松墨天牛寡糖基转移酶亚基STT3B的克隆与表达分析

蔡紫玲，吴华俊，林 同

（华南农业大学林学与风景园林学院，广东广州 510642）

松墨天牛寡糖基转移酶亚基STT3B的克隆与表达分析

蔡紫玲，吴华俊，林 同

（华南农业大学林学与风景园林学院，广东广州 510642）

为阐明松墨天牛寡糖基转移酶亚基STT3B的结构特点和在不同虫态、成虫的不同部位以及幼虫组织中的表达情况，采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和快速扩增cDNA末端（RACE）技术克隆松墨天牛STT3B基因cDNA，命名为MaSTT3B，其GenBank登录号为KT362368。序列分析显示其长度为2 552 bp，其中开放阅读框长2 322 bp，编码773个氨基酸。MaSTT3B的氨基酸序列与赤拟谷盗相似性最高，为93%，在系统发育树的同一个分支上。用实时荧光定量PCR分析MaSTT3B的相对表达量，结果表明：STT3B在蛹中的表达量高于成虫；在成虫足的表达量最高；在幼虫各组织中，体壁的相对表达量最高。

松墨天牛；STT3B；基因克隆；RT-qPCR

真核寡糖基转移酶（OST）位于内质网（ER）腔内，参与多肽N-糖基化的催化，是一种高度保守的蛋白质［1］。一系列的研究发现酵母和脊椎动物的OST包含了7或8个亚基（酵母：Ost1p、Ost2p、Ost3p/Ost6p、Ost4p、Ost5p、Stt3p、Wbp1p和Swp1p；脊椎动物：ribophorin I、DAD1、N33/IAP、OST4、STT3A/STT3B、Ost48和ribophorin II）［2］。其中，哺乳动物细胞的催化亚基STT3A和STT3B是一组辅助单元［3］，其酶动力学特性和底物都不同，但在N-糖基化时有部分功能重叠［4］。STT3A紧邻蛋白易位通道，保证NXT/S位点的共翻译糖基化，STT3B则修正STT3A遗漏的受体位点［5］。

松墨天牛（Monochamus alternatus Hope），又名松褐天牛，属于鞘翅目（Coleoptera），天牛科（Cerambycidae），是重要检疫性有害生物松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus（Steiner&Buhrer））的主要传播媒介［6-7］。

近年来，国内外对酵母、植物、人类和哺乳动物的OST及其各亚基的克隆、表达和功能结构等研究较多，而昆虫STT3B的研究未见报道。本试验通过对松墨天牛STT3B基因进行克隆及表达分析，为研究STT3B在昆虫中的功能奠定基础理论，为糖基化修饰研究提供有力支持。

1 材料和方法

1.1 供试天牛

松墨天牛采集于广州市从化区马尾松次生林，使用人工饲料饲养［8］。分别收集交配期成虫的头（去除触角）、胸、足、翅、触角、腹节等样品；以及松墨天牛的3龄幼虫及其体壁、脂肪体、血淋巴、中肠、马氏管等样品；同时收集10 d蛹及羽化3 d的松墨天牛成虫。样品置于液氮中迅速冷却后，放于-80℃冰箱保存。

1.2 主要试剂

E.Z.N.A.TMTotal RNA KitⅡ总RNA提取试剂盒为OMEGA公司产品；IPTG、X-Gal等试剂购自上海生工生物工程有限公司；PrimeScript RT reagent Kit W ith gDNA Eraser反转录试剂盒、3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase试剂盒、pMD20-T Vector试剂盒、E.coli DH5αCompetent Cells、SYBR Premix Ex TaqTM实时荧光定量试剂盒等试剂为TaKaRa公司产品；通用型DNA纯化回收试剂盒购自天根生物有限公司。

1.3 总RNA提取和反转录

采用RNA抽提试剂盒说明书的方法来提取松墨天牛各样本的总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳对RNA质量进行检测，以及微量紫外分光光度仪（Nanodrop 2000）对RNA浓度进行检测后，确定RNA质量和浓度符合试验要求，置于-80℃冰箱保存备用。按PrimeScript RT reagent KitW ith gDNA Eraser反转录说明书将RNA反转录为单链cDNA，稀释10倍用作实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的模板。

1.4 引物设计

从昆虫分子生物学实验室已构建的松墨天牛cDNA文库［9］中筛选出一段糖基转移酶亚基基因STT3B序列，以此序列为基础，利用Primer prem ier 5.0软件设计引物，Outer：5′-GAGTTGGTGGGATT ATGGG-3′和Inner：5′-AGGACATTAGGGAAAGCG-3′用于3′RACE；设计引物Forward（正向）：5′-CATA CGGAAGCGATGGAACT-3′和Reverse（反向）：5′-CC CATAATCCCACCAACTCA-3′，用于RT-qPCR。引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.5 松墨天牛STT3B的3′RACE扩增及序列分析

1.5.1 3′RACE扩增 以合成的cDNA为模板，加入10×Ex Taq聚合酶反应缓冲液2.5μL（含Mg2+），正向和反向引物各0.5μL（10μmol/L），dNTP 2μL（2.5μmol/L），Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL（5 U/μL），加ddH2O至25μL，混匀离心（3 000 r/min 10 s）后进行PCR扩增。

将特异性引物Outer及试剂盒中提供的通用引物1进行第1轮PCR，反应条件为：94℃预变性3 min；94℃30 s，55℃30 s，58℃30 s，72℃1 m in，20个循环；72℃延伸10 m in。特异性引物Inner及通用引物2进行第2轮PCR。PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 m in，30个循环；72℃延伸10 m in。反应结束后，取5μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5.2 基因克隆及序列测定 3′RACE产物通过回收纯化后进行pMD20-T克隆载体连接过夜，再转化到感受态大肠杆菌DH5α中，37℃培养箱培养重组质粒12 h，经氨苄青霉素和蓝白斑进一步筛选，挑取白斑质粒培养3 h后，提取白斑质粒进行DNA检测。测序交给上海生物工程有限公司完成。

1.5.3 核苷酸序列及其编码氨基酸序列分析 测定序列拼接完成后，先用Blast程序（http：//blast.stva.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行相似性比对分析，并用ORF Finder程序（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/gorf/）搜索开放阅读框（ORF），获得一条带有完整ORF且与昆虫寡糖基转移酶亚基STT3B同源的序列；用ProtParam tool（http：//web. expasy.org/protparam/）计算蛋白质的等电点与分子量，NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/）分析磷酸化位点，SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测蛋白质信号肽，DictyOGlyc 1.1 Serve（http：// www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/）预测糖基化位点，ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白质的疏水性，Coils（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.htm l）预测卷曲结构。

1.5.4 构建系统发育树 从NCBI（http：//www. Ncbi.nlm.Nih.gov/）GenBank数据库中检索昆虫STT3B的氨基酸序列，用DNAMAN软件进行同源性比对；用ClustalX和MEGA 4.0软件构建昆虫STT3B系统发育树（NJ法）。

1.6 实时荧光定量PCR

以微管蛋白（β-actin）基因为内参基因，无菌超纯水为阴性对照，以松墨天牛STT3B在成虫的表达量为标准参量来测定其在各虫态和成虫各部位的表达量，以松墨天牛STT3B在幼虫的表达量为标准参量来测定其在幼虫各组织的表达量。实时荧光定量PCR反应体系为10.0μmol/L的上、下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，10.0μL SYBR Premix Ex-Taq，加入ddH2O至20μL；设置ddH2O为阴性对照，每个样本3次重复。放入LightCycler480荧光定量PCR仪扩增。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃复性20 s，进行40个循环；40℃冷却30 s。反应结束后采集目标基因的Ct值和2个内参基因的Ct平均值，利用2-ΔΔCT相对定量法计算相对表达量［10］。

2 结果与分析

2.1 松墨天牛STT3B基因序列分析

本试验克隆了松墨天牛糖基转移酶基因cDNA，命名为MaSTT3B（GenBank登录号：KT362368），全长2 552 bp（图1），其中包含开放阅读框（ORF）2 322 bp， 230 bp的3′端非编码区，ORF编码773个氨基酸残基，推测的分子式为C4061H6171N1013O1091S25，分子量为87.442 3 kDa，等电点为8.91，稳定系数为63.14，为稳定蛋白。疏水性最大值为3.933，最小值为-3.001，是亲水蛋白。MaSTT3B有8个苏氨酸磷酸化位点，26个丝氨酸磷酸化位点，10个酪氨酸磷酸化位点，无糖基化位点、螺旋卷曲和信号肽。

2.2 序列相似性和系统发育树

将MaSTT3B氨基酸序列与NCBI数据库中的17种昆虫STT3B的氨基酸序列进行同源性比对（图2），其中，STT3B与赤拟谷盗相似性最高，为93%，与内华达古白蚁的相似性为84%，与其他昆虫的相似性都大于75%。大多数膜翅目昆虫的STT3B亚基由约800个氨基酸组成，而双翅目、鞘翅目、半翅目昆虫则由约770个氨基酸组成。本研究克隆的松墨天牛STT3B的开放阅读框全长2 322 bp，能编码773个氨基酸残基，而其亲缘关系最近的赤拟谷盗STT3B的编码区能编码了776个氨基酸。

图1 MaSTT3B的核苷酸及其编码氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and encoding am ino acid sequences of MaSTT3B

图2 松墨天牛与其他16种昆虫STT3B编码氨基酸序列比对Fig.2 Am ino acid sequence alignm ent of STT3B from M.alternatus and other insects

图3 基于昆虫寡糖基转移酶亚基STT3B氨基酸序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic relationships of insects based on STT3B am ino acids

基于18种昆虫的寡糖基转移酶亚基STT3B序列构建的系统进化树显示（图3）：松墨天牛与赤拟谷盗（Tribolium castaneum）遗传距离最近，在同一分支；与欧洲熊蜂（Bombus terrestris）等遗传距离较远。

2.3 松墨天牛STT3B的表达分析

用荧光定量RCR法分析了STT3B在松墨天牛不同虫态、成虫各部位和幼虫各组织的表达模式。MaSTT3B在蛹的表达量最高，幼虫的表达量最低，蛹和幼虫的相对表达量分别是成虫的1.10，0.17倍，基因表达在三者之间差异显著（P＜0.05）（图4）。成虫各部位的表达模式为：足的表达量最高，为对照（对照值为1）的11.55倍，翅膀的表达量最低，为对照的0.12倍，头、胸、腹、触角分别为对照的2.60，2.79，2.13，0.53倍，成虫各部位MaSTT3B基因表达有显著差异（P＜0.05）（图5）。幼虫各组织的表达模式为：体壁的表达量最高，为对照的30.27倍，中肠的表达量最低，为对照的0.10倍，脂肪体、血淋巴、马氏管分别为对照的3.58，1.14，0.30倍，幼虫各组织MaSTT3B基因表达有显著差异（P＜0.05）（图6）。图4-6中数据为平均数±标准误；柱上不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

图4 STT3B在松墨天牛不同虫态的表达Fig.4 The expression of STT3B in various instars of M.alternatus

图5 STT3B在松墨天牛成虫不同部位的表达Fig.5 The exp ression of STT3B in different parts of M.alternatus adu lt

图6 STT3B在松墨天牛幼虫不同组织中的表达Fig.6 The exp ression of STT3B in various tissues of M.alternatus larvae

3 讨论

STT3是一个高度保守的亚基，它含有一个Ncyt-Clum拓扑结构和11个跨膜螺旋［11］，3′端有WWDYG与DK 2个保守的基序［12］，可分为STT3A和STT3B 2个亚基。本试验采用RACE技术获得了松墨天牛一段完整序列，通过Blast比对，发现比对的序列都为STT3B，其中以已测定基因组的赤拟谷盗最为相似，相似性达到93%，与其他昆虫氨基酸序列的相似性在75%以上，因此可确定该序列为STT3B，命名为MaSTT3B。大多数膜翅目昆虫的STT3B亚基由约800个氨基酸组成，而双翅目、鞘翅目、半翅目昆虫则由约770个氨基酸组成。本试验克隆的松墨天牛STT3B的开放阅读框全长2 322 bp，能编码773个氨基酸残基，而其亲缘关系最近的赤拟谷盗STT3B的编码区能编码了776个氨基酸。

N-糖基化有调节蛋白质功能的作用，更有少数蛋白需要N-糖基化才可表达其正常功能，比如内肽酶［13］、GD3合酶（α-2，8-唾液酸基转移酶）［14］、GM2合酶（β-1，4-N乙酰半乳糖氨基转移酶）［15］和高亲和性免疫球蛋白E受体等［16］。寡糖基转移酶（OST）作为参与蛋白质糖基化过程的多种酶之一，含有7或8个亚基，但仅有催化亚基STT3A和STT3B有催化功能，能催化核心寡糖由多萜醇二磷酸核心寡糖转移至新合成肽链的NXS/T序列中的天冬酰胺残基上形成N-糖苷键。NXS/T序列是蛋白质N-糖基化的标志，分别为天冬氨酸-X-丝氨酸/苏氨酸（Asn-X-Ser/Thr），X可以是除了脯氨酸（Pro）外的任何氨基酸。Malaby等［17］发现在糖基化过程中，如果NXS位点含有大量的疏水性和带负电荷的残基，STT3A和STT3B就无法作用这些位点。

鉴于糖基化的重要性，OST亚基STT3B一直是研究的热点。但目前，STT3B的研究集中在结构和功能上，多以酵母、小鼠等为试材，并未有涉及昆虫领域。在糖基化过程中，糖链不仅需要糖基转移酶的作用，还要具有位点特异的性质，也即是要有糖基化位点［18-19］。那么STT3B本身是否含有糖基化位点呢？经分析，MaSTT3B无糖基化位点、信号肽。比较本试验中的其他16种昆虫的STT3B，除了丽蝇蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）在438位的丝氨酸含有一个糖基化位点外，其他都无糖基化位点和信号肽，可见STT3B在结构上比较保守，一般不含糖基化位点和信号肽，这可能跟其功能相适应。

STT3B能修饰STT3A在糖基化过程中的遗漏位点，特别是蛋白序列C末端。Shrimal等［20］表明糖基化氨基酸序列的C端和内部的糖基化位点（NXT/NXS）功能相同，一般由STT3B修饰，而不是STT3A。同时，STT3B参与内质网介导的降解途径，但其具体机制有待于进一步分析。

本试验克隆了MaSTT3B基因，分析了该基因编码氨基酸序列特征，并采用RT-PCR技术对其在松墨天牛各发育时期和各组织的表达差异性进行了分析，发现MaSTT3B在蛹、足、体壁等的表达量较高。蛹是幼虫转变为成虫的过渡状态，体内组织发生各种生理活动，新陈代谢比幼虫和成虫更快。足是运动器官，肌肉发达，含有大量蛋白质。体壁起着保护作用，含较多的几丁质和蛋白质。因此，笔者猜测是由于在这三者中蛋白质合成代谢较为活跃，需要更多的STT3B参与N-糖基化。当然，STT3B在松墨天牛中的具体功能还需要更进一步地深入研究。

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Cloning and Expression Analysis of STT3B of O ligosaccharyltransferase from Monochamus alternatus

CAIZiling，WU Huajun，LIN Tong
（College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

In order to analyze the structure characteristics of MaSTT3B and its expression in the different development stages，different parts of adults and different tissues in larvae，we cloned the STT3B gene of Monochamus alternatus named MaSTT3B（GenBank accession number：KT362368）using the technology including reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）and rapid amplification（RACE）.The total sequence length of MaSTT3B is 2 552 bp，including 2 322 bp open reading frame encoding 773 am ino acids.The am ino acid sequence of MaSTT3B has 93%similarity to Tribolium castaneum，and both of them are in the same branch of phylogenetic tree based on insect STT3B.The result of RT-qPCR indicated that MaSTT3B was expressed higher in pupae than in adults，in adult′s legs than in other parts of adults，and highest in body wall of among larvae tissues.The relative expression levels of MaSTT3B was detected by RT-qPCR indicated that MaSTT3B was expressed higher in pupae than in adults，in adult′s legs than in other parts of adults，and highest in body wall of among larvae tissues.

Monochamus alternatus；STT3B；Gene cloning；RT-qPCR

Q966；Q78 文献标识码：A 文章编号：1000-7091（2016）03-0080-08

10.7668/hbnxb.2016.03.012

2016-03-12

国家自然科学基金项目（31470653）；广东省自然科学基金项目（1414050001666）

蔡紫玲（1992-），女，广东茂名人，在读硕士，主要从事昆虫分子生物学研究。

林 同（1969-），男，黑龙江通河人，副教授，博士，主要从事昆虫分子生物学研究。