花粉致死基因ZmAA1对玉米遗传转化的研究

孟令聪，宋广树，2，吕庆雪，刘宏伟，2，张志军，2，李春雷，王 敏，刘文国，2

（1.吉林吉农高新技术发展股份有限公司，吉林公主岭 136100；2.吉林省农业科学院，吉林长春 130124）

花粉致死基因ZmAA1对玉米遗传转化的研究

孟令聪1，宋广树1，2，吕庆雪1，刘宏伟1，2，张志军1，2，李春雷1，王 敏1，刘文国1，2

（1.吉林吉农高新技术发展股份有限公司，吉林公主岭 136100；2.吉林省农业科学院，吉林长春 130124）

为了研究花粉致死基因ZmAA1的功能，进而创制转ZmAA1基因玉米不育新材料。在GenBank中找到花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47，并在目的片段的上下游设计増加酶切位点，基因合成构建到克隆载体puc57上，采用传统酶切连接的方法构建了植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar，并利用农杆菌介导法转化优良玉米自交系郑58萌动胚。成功构建植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar；共获得94株除草剂抗性植株，其中47株目的片段PCR呈阳性反应，对温室中表现为花粉败育的PCR阳性植株进行目的片段及筛选标记bar基因RT-PCR与蛋白免疫学试纸条检测，结果表明，花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47已经整合到玉米基因组并表达。

玉米；ZmAA1基因；启动子Pg47；遗传转化

近几十年来，杂种优势在玉米生产上已取得了举世瞩目的成就，杂种优势利用的关键环节是选育作物雄性不育系。但是传统细胞质雄性不育系存在不育机理复杂［1-5］，对环境因素影响敏感，存在周期长、见效慢、杂交不亲和组合选育局限大等问题，远不能满足生产发展的需要。随着现代生物技术的快速发展，通过转基因技术手段，利用基因工程获得植物雄性不育已成为主流，为植物雄性不育开辟了崭新的途径［6］。基因工程雄性不育是专一性地影响花药花粉的正常发育，导致雄蕊失去其自身功能。基因工程方法避免传统杂交育种的生殖隔离及远缘杂交分离的现象，能够保持优良性状的遗传和表达［7-9］。因此，利用基因工程创造雄性不育已成为利用的热点。利用基因工程获得雄性不育植株可以避免植物花粉、种子、果实等对环境造成的污染，对维持人体健康具有显著意义［10］。基因工程不育还能有效控制外源基因通过花粉或种子逃逸到自然环境中，有利于转基因植物的田间释放及商业化生产［11］。

基因工程创建雄性不育系的经典方法是以对细胞具有毒性作用的蛋白质或酶基因作为目的基因，与花药或花粉特异表达的启动子构建植物表达载体，导入受体植株影响花粉正常发育导致雄性不育［12］。目前，Zmc13、5126和Pg47是从玉米中克隆的研究比较详细的花粉致死基因的特异启动子。利用现代生物育种技术，将花粉致死基因的特异启动子与目的基因连接，构建植物表达载体，遗传转化后使其在花粉中特异表达引起植物花粉败育，获得雄性不育系。ZMAA1基因是玉米基因编码的α淀粉酶蛋白，属于家族糖基水解酶，催化水解多糖分子（1-4）-α-D-糖苷键，并通过花粉发育后期特异启动子Pg47驱动该基因表达，水解淀粉使花粉不育。通过基因工程创造植物雄性不育系已在一些作物上获得了成功，利用雄性不育系制种是提高玉米杂交种种子质量最有效的途径之一。

本试验以ZMAA1基因及花粉致死基因的特异启动子Pg47为研究对象，构建植物表达载体，采用农杆菌侵染萌动胚方法进行玉米的遗传转化，旨在创制转Pg47-ZmAA1基因玉米不育系新材料，为玉米杂种优势利用创建基础材料。

1 材料和方法

1.1 供试材料

植物材料：优良玉米自交系郑58。菌株与质粒：农杆菌菌株为LBA4404及EHA105，puc-Pg47-ZmAA1质粒及载体质粒pCAMBIA3300为吉林省农业科学院玉米研究所保存。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉致死基因ZmAA1表达载体的构建和鉴定 用Hin dⅢ和Eco RⅠ对puc-Pg47-ZmAA1质粒和pCAMBIA3300载体质粒进行双酶切，T4连接酶连接回收的目的片段和载体片段，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞进行大肠杆菌的转化，挑取单菌落提取质粒进行酶切检测及核苷酸序列测定并绘制质粒图谱［13］，重组质粒命名为pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar。采用传统热击法将重组质粒pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar转入农杆菌LBA4404及EHA105中，并对转化后的农杆菌菌液进行PCR鉴定。

1.2.2 ZmAA1基因对玉米的遗传转化 侵染液的准备：挑取LBA4404及EHA105菌株（含目的质粒），于100 m L液体YEP培养基中（含有100 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平），28℃200 r/m in摇菌12 h，侵染前将菌液浓度稀释至OD600≈0.8，用以侵染玉米萌动胚。

试验材料的准备：20%次氯酸钠消毒郑58玉米种子10 min，无菌水冲洗3次，在超净台里用解剖刀破坏玉米萌动胚的生长点约1～3 mm后浸泡于无菌水中，37℃水浴约4～5 h。

农杆菌侵染萌动胚：在超净台里将无菌水倒净，将制备好的加入100μmol/L AS的农杆菌工程菌液倒入其中，28℃220 r/min侵染24 h，然后把种子放在MS固体培养基上共培养2～4 d。

移栽：用高温灭菌水洗掉菌体，移栽至花盆中，待长到三叶期喷洒5 mg/L PPT进行筛选，培养7 d左右，除去矮化、生长缓慢的植株，选择抗性植株移栽到温室中。

1.2.3 转化植株T0的PCR检测 按照CTAB法提取玉米植株雄穗发育的小花分化期的DNA。针对Pg47基因及ZmAA1基因连接部位设计引物进行PCR检测。引物序列为：PZ-F：5′-CAGGCAACAAG AGACACGA-3′；PZ-R：5′-CTGGATGGGTGAGGATG TA-3′。

1.2.4 转化植株T0的RT-PCR检测及蛋白免疫学试纸条检测 对温室中表现为花粉败育的PCR阳性植株进行了RT-PCR检测。以玉米雄穗发育的小花分化期的RNA为模板，合成cDNA第一链。取2μL反应液为模板，针对目的片段及筛选标记基因bar进行RT-PCR检测，产物1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。引物序列为：bar-F：5′-ACAAGCACGGTCAA CTTCC-3′PZ-F；bar-R：5′-ACTCGGCCGTCCAGTCG TA-3′PZ-R。

选用Envirologix公司的bar免疫学试纸条，以非转基因植株为空白对照，对温室中表现为花粉败育的PCR阳性植株T0转化体进行免疫学蛋白检测。取玉米雄穗发育的小花分化期的花药放在1.5 m L的Eppendorf管中。液氮将材料速冻，用钻头将材料研磨成粉，向管中迅速加入500μL样品提取缓冲液，将标记的末端插入至离心管中，3～5 min内出现质控线，最长反应时间为30 min。

2 结果与分析

2.1 ZmAA1基因玉米单子叶植物表达载体构建结果

用Hin dⅢ和Eco RⅠ对puc-Pg47和载体质粒pCAMBIA3300进行双酶切处理，1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收4 407 bp目的基因片段和8 377 bp载体大片段。T4连接酶连接产物转化大肠杆菌DH5α，活化单菌落，提取质粒进行酶切及核苷酸序列测定（图1-2）。结果表明，表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar中的Pg47、ZmAA1基因与原始基因序列完全一致，质粒图谱见图3。将其导入农杆菌菌株LBA4404及EHA105中，并对转化的单菌落进行PCR检测，能够扩增出1 232 bp的目的片段，结果表明重组质粒已经成功转入农杆菌中（图1）。

图1 载体pCAM BIA3300-Pg47-Zm AA1-35s-bar的构建Fig.1 Construction of vector pCAM BIA3300-Pg47-Zm AA1-35s-bar

2.2 Zm AA1基因转化玉米的结果

本试验转化优良玉米自交系郑58共2 200个萌动胚，其中LBA4404菌株侵染1 000个萌动胚及EHA105菌株侵染1 200个萌动胚，共获得94株除草剂抗性再生植株。由表1可见，2种菌株的抗性率存在差异，分别为5.30%和3.42%，转化过程见图4。

图2 部分序列比对结果示意图Fig.2 Partial sequence com parison between digested fragm ent and original gene

图3 pCAM BIA3300-Pg47-Zm AA1-35s-bar载体结构示意图Fig.3 Sketch m ap of construction of pCAM BIA3300-Pg47-Zm AA1-35s-bar

表1 Zm AA1基因转化玉米郑58的结果Tab.1 The resu lts of Zm AA1 transgenic m aize

2.3 转化植株T0的PCR检测结果

对94株除草剂抗性转基因植株进行PCR检测。其中的47株扩增出1 232 bp的目的片段，初步证明Pg47、ZmAA1 2个基因已经整合到玉米花药中（图5）。

图4 农杆菌介导玉米萌动胚的遗传转化Fig.4 Agrobacterium-m ediated transform ation of m aize germ inating em bryos

图5 目的片段PCR检测结果Fig.5 PCR am p lification resu lts of Pg47-Zm AA1 gene

2.4 转化植株T0的RT-PCR检测及蛋白免疫学试纸条检测结果

图6 T0转基因玉米株系的RT-PCR检测结果Fig.6 RT-PCR am p lification resu lts of transgenic p lants in T0 generation

图7 bar基因RT-PCR检测结果Fig.7 RT-PCR am p lification resu lts of bar gene

对温室中9株表现为花粉败育的PCR阳性植株进行了RT-PCR检测，5株花药能够扩增出1 232 bp的目的片段（图6），其中3株能扩增出bar基因175 bp目的基因片段，试验结果表明筛选标记bar基因转化植株中已经正常转录表达（图7），9株表现为花粉败育T0转基因玉米bar蛋白免疫学试纸条检测，结果表明筛选标记bar基因转化植株中，进一步验证了Pg47、ZmAA1 2个基因已在T0转基因玉米花药中表达（图8）。

3 讨论

图8 再生植株免疫学试纸条检测Fig.8 bar imm unological test strip test of T0 transgenic p lants

利用人工和机械去雄，增加了制种成本，同时质量也难以保障，提高种子纯度、降低制种成本是当前玉米生产上急待解决的问题［14］。基因工程技术的应用与发展和分子生物学的深入研究为创造植物雄性不育开辟了一条崭新的途径。基因工程方法获得植物雄性不育的关键是影响花粉正常发育，因此，花粉或花药特异性表达的启动子的应用已成为当前研究的重点［15-16］。目前，已经克隆到一些花药或花粉特异性表达的基因及启动子，并应用于植物雄性不育系统，美国杜邦先锋公司发明了一种新型杂交种子生产技术体系-SPT（Seed production technology）技术，花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47应用其中［17］。但是，大多国外的研究者开发的基因和技术具有知识产权保护，因此，国内学者克隆雄性不育新基因及创建新技术迫在眉睫。

农杆菌介导玉米遗传转化有多种受体类型，不同玉米受体类型对农杆菌的敏感性不尽相同［18］。农杆菌侵染玉米萌动胚是近几年快速发展起来的遗传转化技术，其优点是试验操作相对简单，对试验条件要求较低，组织培养周期短、避免了产生变异不育株和转化效率降低等现象，打破了基因型对于植株再生频率的限制性［19］。王昌涛等［20］以玉米萌动胚为受体，采用农杆菌介导法进行转化，得到PCR阳性植株11个，转化率为0.275%。张慧杰等［21］采用先水浴种子后划胚的方法将BHMT基因导入玉米基因组中，转化率为0.6%。

本试验成功构建植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar，利用农杆菌介导法转化优良玉米自交系郑58萌动胚，通过花粉发育后期特异性启动子Pg47驱动获得转基因不育系新材料，经过PCR和RT-PCR验证及蛋白免疫学试纸条检测，初步证明外源基因已经整合到基因组中，为玉米杂种优势利用创建基础试材。

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Study on Transform ation in M aize of Pollen Lethal Gene Zm AA1

MENG Lingcong1，SONG Guangshu1，2，L Qingxue1，LIU Hongwei1，2，ZHANG Zhijun1，2，LIChunlei1，WANG Min1，LIU Wenguo1，2
（1.Jilin Jinong Agricultural New and Hi-Tech Develop Co.，Ltd，Gongzhuling 136100，China；2.Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130124，China）

In order to study the function of pollen lethal gene ZmAA1 and create tansgenic male sterile materials.ZmAA1 and its specific promoter Pg47 were found according to GenBank，designed to plus restriction endonuclease on the downstream and inserted them into an cloning vector puc57，construction of vector pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar used traditional construction methods digested connection.A maize inbred line Zheng 58 was infected by Agrobacterium tumefacfaciens with the vector pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar，94 PPT-resistant seedlings were obtained and 47 plants were PCR positive.The pollen sterility in greenhouse RT-PCR assay for gene bar in the transgenic plant leaves and immuno strip test suggested that pollen lethal gene ZmAA1 had been integrated into the maize genome，and protein was expressed.

Maize；ZmAA1 gene；Pg47 promoter；Genetic transformation

S513.03 文献标识码：A 文章编号：1000-7091（2016）03-0101-06

10.7668/hbnxb.2016.03.015

2016-03-20

吉林省科技厅产业技术创新战略联盟项目（20140309005NY）；国家支撑计划项目（204BAD01B01）

孟令聪（1988-），女，吉林扶余人，研究实习员，硕士，主要从事玉米遗传育种研究。孟令聪、宋广树为同等贡献作者。

刘文国（1971-），男，黑龙江牡丹江人，研究员，博士，主要从事玉米遗传育种研究。

张志军（1972-），男，黑龙江双鸭山人，研究员，硕士，主要从事玉米遗传育种研究。