青海省海西州藏系绵羊鼠疫调查分析

李积成，祁美英，代瑞霞，杨汉青，熊浩明，靳　娟，杨晓艳，杨永海，赵小龙，魏柏青



青海省海西州藏系绵羊鼠疫调查分析

李积成，祁美英，代瑞霞，杨汉青，熊浩明，靳娟，杨晓艳，杨永海，赵小龙，魏柏青

青海省地方病预防控制所鼠疫预防控制科，西宁811602

摘要：目的对青海省海西州开展藏系绵羊鼠疫病原学和血清流行病学调查，了解当地藏系绵羊鼠疫流行情况。方法应用鼠疫间接血凝试验(IHA)、胶体金纸上色谱(GICA)两种方法，对该地区1 813份藏系绵羊血清进行了检测；对分离自当地藏系绵羊的1株鼠疫菌进行生化试验、毒力测定、毒力因子鉴定、质粒分析、差异片段(DFR)分型等研究。结果采用IHA和GICA方法分别对所采集的1 813份藏系绵羊血清进行检测，均检出鼠疫Fl抗体阳性血清15份，阳性率为0.83%。其中，从德令哈市检出阳性血清7份，3份滴度为1∶20，3份滴度为1∶40, 1份滴度为1∶80；乌兰县检出阳性血清8份，滴度均为1∶20。同时，证实鼠疫菌株的生态型为青藏高原型，毒力因子及毒力检测结果显示该株鼠疫菌为强毒菌，基因型(DFR )为8型，质粒谱6×106、45×106、52×106 。结论该地区存在藏系绵羊鼠疫流行，所分离的鼠疫菌株具备青藏高原鼠疫病原体特性。因此，应加强藏系绵羊鼠疫的监测工作，尤其是旱獭鼠疫流行地区。

关键词：鼠疫；藏系绵羊；血清流行病学；病原学；海西蒙古族藏族自治州

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1975年8月，青海省玉树州玉树市上拉秀地区首次证实了藏系绵羊﹙以下简称藏羊﹚能自然感染鼠疫并成为人类鼠疫的传染源[1]，以后陆续从该州的囊谦、杂多以及海西州的德令哈市藏羊体内分离出鼠疫菌。到目前为止，青海省自藏系绵羊材料中分离出鼠疫菌14株，由藏羊引发的人间鼠疫有10起，发病25人，死亡13人。无论是从鼠疫菌的分离数量还是作为传染源引发的人间鼠疫病例，藏羊的流行病学意义仅次于旱獭而位于第2位[2]。近年来，随着交通条件的改善和发展，海西州境内青藏铁路大部分路段都处于鼠疫疫源地，且这块疫源地是我国最活跃、鼠疫菌毒力最强的鼠疫疫源地之一，因此，海西州的鼠疫防控工作是近十几年来全省乃至全国关注的焦点，由于藏羊鼠疫来自旱獭鼠疫，且每年还有相当数量的未经深加工的藏羊畜产品(例如生肉、皮张等)运往全国各地，为非疫源地区输入藏羊鼠疫创造了一定条件。 因此，藏羊鼠疫存在的现实风险是不能忽视的。为了解海西蒙古族藏族自治州藏羊鼠疫流行状况，我们对该地区藏羊鼠疫血清流行病学及病原学特征进行了调查研究，现将结果报告如下。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验菌株与资料来源1996年8月从海西州德令哈市郭里木地区藏羊鼠疫分离出1株鼠疫菌株，由青海省地方病预防控制所国家鼠疫菌种保藏中心提供。藏羊鼠疫背景资料由青海省鼠疫防治信息资源库提供。

1.1.2藏羊血清及样本处理2013-2014年采集海西州藏系绵羊血液样本1 813份，其中德令哈市275份，格尔木市204份，乌兰县538份，都兰县210份，天峻县206份，茫崖、冷湖、大柴旦行政委员会共380份。将藏系绵羊血液样本进行血清分离、低温分装， 56 ℃水浴、30 min灭活，-20 ℃保存备用。

1.1.3实验动物为昆明系小白鼠，清洁级，30只，质量18～20 g，由青海省实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1毒力测定按常规方法进行菌株毒力测定,计算最小致死量(MLD)，并参照朱锦沁等[3]对青海省鼠疫菌株毒力等级进行分类。

1.2.2细菌表型特征按常规方法进行鼠疫菌生化、糖醇类酵解试验、毒力因子等表型特征的研究，根据传统的鼠疫菌生态型6项指标进行鼠疫菌生态型分析[4]。

1.2.3质粒分析参照文献[5]的方法进行，质粒DNA相对分子质量(Mr)的测定采用标准质粒对照法。

1.2.4鼠疫菌DNA的提取DNA提取按照经典的苯酚-氯仿混合抽提法进行[5]。

1.2.5细菌差异片段(different region，DFR)分型用23对DFR(DFR01～DFR23)分型引物和PMT1(质粒验证引物)，同时检索中国鼠疫菌DFR分型数据库[6-7]，对被试菌株DNA进行分型验证，以91001、620024菌株DNA的等量混合物为阳性对照，同时设置阴性对照，引物序列及结果分析参见文献[6-7]。

1.2.6血清检测方法鼠疫间接血凝试验(IHA)、胶体金纸上色谱(GICA)方法参照《鼠疫诊断标准》(WS279—2008) 及附录E、F。

2结果

2.1藏羊鼠疫菌病原学特征

2.1.1藏羊鼠疫菌生化特性1株被试菌株均能分解阿胶糖、麦芽糖和甘油，不分解鼠李糖及密二糖，脱氮阳性，生态型为青藏高原型。

2.1.2藏羊鼠疫菌毒力测定及毒力因子试验对1株被试鼠疫菌小白鼠毒力测定，MLD为1 000个菌，毒力因子试验显示，均能产生荚膜抗原(Fl)、鼠疫杆菌素I(PstI)、毒力抗原因子(VW)、色素沉着因子(Pgm)，为强毒株。

2.1.3藏羊鼠疫菌质粒谱试验显示，该株鼠疫菌携带有3种质粒，相对分子质量(Mr)分别为6×106、45×106、52×106。

2.1.4藏羊鼠疫菌基因型检索中国鼠疫菌DFR分型数据库，23个DFR 和PMT1 进行PCR扩增后显示，该菌株为8型。

2.2血清学调查采用IHA和GICA两种方法分别对所采集的1 813份藏系绵羊血清进行检测，均检出鼠疫Fl抗体阳性血清15份，阳性率为0.83%。其中，德令哈市检出阳性血清7份，3份滴度为1∶20，3份滴度为1∶40, 1份滴度为1∶80；乌兰县检出阳性血清8份，滴度均为1∶20。见表1。

3讨论

海西州位于青海省西北部,是青、甘、新、藏四省区交往的中心地带。境内平均海拔3 500～4 000 m,面积30万km2，人口48.9万。1957年该州天峻县首次自喜马拉雅旱獭体内分离出鼠疫菌,判定为鼠疫自然疫源地，以后陆续判定都兰、乌兰、格尔木、冷湖、茫崖、德令哈为疫源县(市、行委)。据疫史资料统计，该地区发生两起由藏羊引起的人间鼠疫。1956年天峻县多石科地区发生肺鼠疫流行，首发患者切罗于7月15日剥食病死藏羊，7月25日发病，症状为高烧、咳嗽、咯血痰、胸痛，未经治疗于7月27日死亡；因看护、探望、埋尸体等先后接触的13人发病(症状同切罗)，死亡11人。1961年都兰县热水乡第二牧业队发生肺鼠疫流行，首发患者松日普于10月15日剥病死藏羊2只，肉被14人分食。10月18日松日普发病，初为腹部不适、腹泻、继之发烧、咳嗽、咯泡沫状血痰，未经治疗于10月23日死亡；因食用同一病死藏羊肉或密切接触松日普等有10人相继发病，9人死亡，并从1具尸体中分离出鼠疫菌。此外，1996年8月从海西州德令哈市郭里木地区病死藏羊分离出鼠疫菌1株，证实该地区存在藏羊鼠疫流行。王祖郧等[7]2005年对海西州青藏铁路沿线藏羊鼠疫进行了血清流行病学调查，对采集的1 523份藏羊血清进行检测，共检出鼠疫Fl抗体阳性血清4份，其中滴度1∶40的3份、1∶80的1份，阳性率2．6‰。藏羊鼠疫对人民群众身体健康和经济发展仍然存在潜在威胁，因此藏羊鼠疫防治应该引起高度重视。

表1　GICA和IHA检测海西州藏系绵羊血清实验结果

本次试验结果显示，采用IHA和GICA方法分别对1 813份藏羊血清进行检测，检出鼠疫Fl抗体阳性血清15份，阳性率0.83%。从德令哈市检出阳性血清7份，乌兰县检出阳性血清8份，可以看出，局部地区存在藏羊鼠疫的流行。2001年青藏铁路格拉段开工建设以来,根据工程卫生保障的要求,连续14年在全州境内铁路沿线开展了鼠疫监测工作。德令哈市2002、2011年从旱獭体内分离到鼠疫菌，乌兰县除2013年外每年都从旱獭体内分离到鼠疫菌。因藏羊分布区与旱獭的自然分布区基本上重叠，加之藏羊与人类生活生产关系密切，因此，在旱獭鼠疫流行地区，藏羊鼠疫的监测工作更不能忽略。

本研究显示，从藏羊鼠疫所分离的1株鼠疫菌生态型为青藏高原型；鼠疫菌毒力测定MLD为1 000个菌，鼠疫菌四个毒力因子俱全，该株鼠疫菌为强毒菌，质粒谱及基因型表明该菌株具备青藏高原鼠疫病原体特性。藏羊对旱獭鼠疫菌呈现非常显著的个体差异，属于高感受中等敏感动物[1]。人类感染藏羊鼠疫后同样具有发病急、病情重、传染性强、病死率高等特点，因此，藏羊鼠疫流行对人类威胁极其严重。

海西州的鼠疫流行历史悠久，疫源地分布广泛，除大柴旦外，其余各市、县、行委都有分布。海西州最近的人间鼠疫发生于2004年，乌兰县相继发生2起人间鼠疫，发病2人，死亡1人、治愈1人，隐性感染2人[9]，由于矿产、旅游资源丰富，境内有青藏铁路和青藏公路穿过，交通比较发达，人口流动频繁，存在鼠疫远距离传播的危险，值得高度重视。此外，改良绵羊、牦牛、藏羊等家畜动物参与鼠疫流行，使鼠疫流行演变出流行周期延长、传播途径更复杂、易感人群基数增加、对人类危害更加严重等许多新的特点。近年来陆续从西藏山羊、藏原羚、岩羊、牦牛等偶蹄类动物分离出鼠疫菌或检测出鼠疫F1抗体[10]。本次调查发现许多牧民有食用病死羊的现象，因此，要广泛开展健康教育活动，在旱獭鼠疫流行地区，除了及时处理旱獭动物间疫情外，禁止在旱獭鼠疫流行区域放牧，在疫区牧民剪羊毛和屠宰期间(每年8月中旬和10月下旬)，更应加强对藏羊鼠疫的监测及各屠宰点的卫生监督工作，防止人间鼠疫的发生和鼠疫远距离传播。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.020

通讯作者：魏柏青，Email:wbq9@163.com

中图分类号：R516.8

文献标识码：C

文章编号：1002-2694(2016)01-0099-03

Corresponding author:Wei Bai-qing, Email: wbq9@163.com

收稿日期：2015-04-22；修回日期:2015-10-15

Investigation and analysis of Tibetan sheep plague in Haixi Autonomous Prefecture, Qinghai Province, China

LI Ji-cheng,QI Mei-ying,DAI Rui-xia,YANG Han-qing,XIONG Hao-ming,JIN Juan,YANG Xiao-yan,YANG Yong-hai,ZHAO Xiao-long,WEI Bai-qing

(DepartmentofPlaguePreventionandControl,QinghaiInstituteforEndemicDiseasesPreventionandControl,Xining811602,China)

Abstract:We conducted the etiology and serology epidemiological investigation of Tibetan sheep plague in Haixi Autonomous Prefecture, in order to understand the epidemic trend of Tibetan sheep plague in this area. We applied both IHA and GICA methods to test 1 813 samples of Tibetan sheep serum and chose one Yersinia pestis strain isolated in this area for biochemical test, toxicity test, virulence factors evaluation, plasmid analysis, and DFR genotyping. We used these two kinds of methods for test of 1 813 samples of Tibetan sheep serum respectively, the results of positive FI antibody both had 15 samples of serum, positive rate was 0.83%. Delingha City had 7 positive serum samples, 3 titer were 1∶20, 3 titer were 1∶40 and the other one was 1∶80. Meanwhile, Wulan County had 8 positive serum sample, titers for both were 1∶20. We confirmed that the strain's ecotype were Qinghai-Tibet Plateau, and the results of virulence factors evaluation and toxicity test showed the strain was velogenic, genomovar(DFR) was genomovar8, plasmid spectrum was 6×106, 45×106, and 52×106, respectively. Haixi Mongolian Tibetan Autonomous Prefecture had the prevalence of Tibetan sheep plague, the strain separated from this area had the characteristics of Qinghai-Tibet plateau plague's pathogen. Therefore, the monitoring of Tibetan sheep plague should be strengthened, especially in Marmot plague epidemic areas.

Keywords:plague; Tibetan sheep; serum epidemiology; etiology; Haixi Mongolian Tibetan Autonomous Prefecture

国家自然科学基金(No.81260438)