2011-2013年河南省鼠伤寒沙门菌耐药与分子分型研究

赵嘉咏，黄丽莉，穆玉姣，谢志强，苏　佳，张白帆，夏胜利，许汴利



2011-2013年河南省鼠伤寒沙门菌耐药与分子分型研究

赵嘉咏，黄丽莉，穆玉姣，谢志强，苏佳，张白帆，夏胜利，许汴利

河南省疾病预防控制中心，郑州450016

摘要：目的分析2011-2013年河南省鼠伤寒沙门菌临床分离株的耐药状况与脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型带型，为以鼠伤寒沙门菌为代表的食源性疾病暴发预警、调查、溯源及公共卫生意义上的抗生素使用策略提供基线与参考数据。方法根据国际PulseNet 细菌性传染病分子分型监测网络公布的沙门菌PFGE分型技术与美国临床与实验室标准协会(CLSI)沙门菌K-B法药敏测试方案，对2011-2013年分离自我省5个哨点医院的72株鼠伤寒沙门菌进行13种抗生素的药敏测试与PFGE分子分型分析。结果72株沙门菌对8类13种抗生素均有不同程度的耐药，有65株为多重耐药菌株(90.3%)，其中耐3～5种的为6株(8.3%)，耐6～8种的为34株(47.2%)，耐9～10种的为10株(13.9%)。72株鼠伤寒沙门菌经Xba Ⅰ酶切与脉冲场凝胶电泳后，获得45种带型，每种带型包含菌株数1～9株不等，相似度区间为65.6%～100%。结论河南省临床分离的鼠伤寒沙门菌耐药状况普遍比较严重，PFGE带型呈现出多样性的同时又具有较显著的优势带型特点，部分带型与其对应的耐药谱具有一定的关联性与相同的聚集性。

关键词：鼠伤寒沙门菌；PFGE；分子分型；药敏测试

Supported by the by the National Science and Technology Major Projects "AIDS and Viral Hepatitis and Other Major Infectious Diseases Prevention and Control"(Nos. 2012ZX10004201 and 2012ZX10004203)

沙门菌属是一种重要的人兽共患病原菌，也是近几年来食源性传染病暴发疫情的常见与主要病原。根据Kauffman-White血清分型表可以分为2 700多个血清型，其中鼠伤寒沙门菌是我国临床最常见的沙门菌致病血清型，其在动物、食品和低龄儿童中的感染率与致病力都很高。目前K-B法药敏测试与脉冲场凝胶电泳(Pulse-field gel electrophoresis,PFGE)是国际上公认的食源性疾病研究与暴发调查、溯源的重要手段，被广泛应用于沙门菌及其他肠道腹泻病的多病原综合监测工作中[1-2]。本研究对3年内分离自河南省的72株鼠伤寒沙门菌进行药敏测试与大片段DNA分子特征分析，为深入了解鼠伤寒沙门菌的多重耐药及分子特性，指导临床合理用药和肠道传染病的防控提供科学依据。

1材料与方法

1.1菌株来源自2011-2013年河南省腹泻病多病原监测系统中收集并分离自病人的72株鼠伤寒沙门菌，其中2011年37株，2012年32株，2013年3株。

1.2主要试剂与仪器

1.2.1主要试剂沙门菌科玛嘉鉴定培养基(法国CHROMAgar)、脑心浸液/M-H琼脂及药敏纸片(英国OXOID)、API20E肠杆菌科细菌鉴定板条(法国bioMérieux公司)、沙门菌诊断血清(丹麦SSI公司)、药敏纸片分配器(英国OXOID公司)、Seakem Glod琼脂糖(美国LONZA公司)、蛋白酶K(英国Roche公司)、限制性内切酶XbaI(大连宝生物公司)、Tris-HCl/EDTA/5XTBE(solarbio公司)。

1.2.2主要仪器VITEK浊度仪(法国bioMérieux公司)、去离子水系统(美国Milipore公司)、SHZ-C型水浴摇床(上海博迅仪器)、三温水浴锅(北京东方精瑞)、Minispin台式离心机(德国Eppendorf)、脉冲场凝胶电泳系统(美国Bio-Rad公司)、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1菌株的生化鉴定与血清分型从沙门菌科玛嘉平板上直接挑取淡紫色菌落转种脑心浸液平板，37 ℃培养16～18 h，0.85%生理盐水制备0.5麦氏浊度菌液，API20E肠杆菌科系统生化鉴定，确定为沙门菌后用沙门菌诊断血清进行O相玻片凝集分型，再利用0.4%营养软琼脂(参见WHO沙门菌鉴定手册)进行H相(1/2相)鞭毛诱导与血清凝集，生理盐水做自凝对照。根据K-W血清分型表确定对应血清型别。

1.3.2药敏试验参照WHO推荐的Kirby-Bauer法，将鼠伤寒沙门菌转种脑心浸液琼脂平板，37 ℃培养16 h后0.85%生理盐水制成0.5麦氏单位悬液。用无菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布于M-H平板表面，用分配器将药敏纸片压盖其上，15 min内送37 ℃温箱培养18 h以后测量各药敏纸片抑菌圈直径，参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2009年标准进行耐药表型判定，大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株[3]。

1.3.3PFGE分型按照国际Pulsenet网络实验室与美国CDC公布的沙门菌脉冲场凝胶电泳标准分型方法，对72株鼠伤寒沙门菌菌株进行分子分型，沙门菌标准株H9812作为分子量标记[4]。限制性内切酶XbaI(50U)，37 ℃酶切2 h。电泳参数：电压6 V/cm，脉冲时间2.2～63.8 s，线性转换，电场角度120°，电泳时间19 h，电泳液温度14 ℃。电泳结束后胶块用GelRed染料染色20 min后纯水清洗30 min后凝胶成像仪拍照(曝光时间3.0 s，去过饱和成像)。

1.3.4数据分析用BioNumerics6.0软件对电泳图谱进行数据分析，绘制聚类分析树状图。聚类算法为非加权配对平均法(UPGMA)，电泳条带位置优化度(Position tolerance)1.5%，相似度100%认定为同一PFGE带型。

2结果

2.1背景资料分析72株鼠伤寒沙门菌男女比例1.5∶1(43∶29)，以男性为主；年龄分布以0～5岁低龄儿童为主(52,72.6%)，尤其以6个月到2岁婴幼儿为主(37,51.2%)；分离时间多集中于每年的5-10月。

2.2药敏测试结果72株鼠伤寒沙门菌对广谱合成类青霉素氨苄西林(AMP)的耐药率为57.14%，对三代头孢类抗生素头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)的耐药率为30.95%，对四代头孢类抗生素头孢吡肟(FEP)的耐药率为9.52%；对一代喹诺酮类抗生素萘啶酸(NAL)的耐药率为54.76%，对三代氟喹诺酮类抗生素环丙沙星(CIP)、诺氟沙星(NOR)的耐药率为11.90%；对氨基糖苷类抗生素庆大霉素(GEN)、链霉素(STR)的耐药率为63.10%；对氯霉素类抗生素(CHL)的耐药率为38.10%；对增效磺胺类抗生素甲氧苄氨嘧啶(TMP)与复方新诺明(SXT)的耐药率为32.14%和68.1%；对四环素(TET)的耐药率为53.57%。72株鼠伤寒沙门菌中耐2种以上抗生素的多重耐药菌株为65株(90.3%)，其中耐3-5种的为6株(8.3%)，耐6-8种的为34株(47.2%)，耐9-10种的为10株(13.9%)。具体数据见表1、2。

表1　72株鼠伤寒沙门菌抗生素药敏检测结果一览表

表2　72株鼠伤寒沙门菌多重耐药谱

2.3PFGE分子分型结果72株鼠伤寒沙门菌经XbaⅠ酶切后共分为45种带型(Dice,positiontolence1.5%),分别命名为TH1-TH45,带型聚类分析见图1。各带型包含菌株数为1～9株不等，带型相似度在65.6%～100%之间，其中TH6、TH12、TH27、TH38包含2株菌，TH18、TH26、TH40包含3株菌、TH16、TH22包含4株菌，TH19包含8株菌，为该血清型主要优势带型，其余33种带型仅包含1株菌。72株鼠伤寒沙门菌PFGE带型与耐药谱之间的关系较为复杂，从型内看，TH16中4株菌的耐药谱相同(AMP-GEN-TMP-NAL-CHL-SXT)，TH12中2株菌的耐药谱相同(AMP-TMP-TET-STR-NAL-CHL-NOR-SXT)，TH19中5株菌的耐药谱相同(AMP-TMP-CIP-TET-STR-NAL-CHL-NOR-SXT)；从型间看，不同带型对应的菌株表现为相同的耐药表型，如TH19中2株菌与TH18型内菌株耐药谱相同(AMP-CTX-CIP-TET-NAL-CHL-NOR)，TH4中3株菌耐药表型与TH40中1株菌表型(AMP-TMP-TET-STR-NAL-CHL-SXT)一致。在单菌株带型对应的耐药谱中，部分带型耐药表型一致，如TH15、TH42与TH44，其余带型无一致性或耐药谱呈现较高的相似性，见图1。

图1　72株鼠伤寒沙门菌PFGE聚类分析图谱

3讨论

3.1能引起人类食源性疾病的非伤寒沙门菌血清型众多。从河南省近3年的监测数据看，位居前3位的血清型分别是鼠伤寒(S.typhimurium)、肠炎(S.enteritidis)和阿贡那(S.agona)或肠炎(S.enteritidis)、鼠伤寒(S.typhimurium)和森芬伯格(S.senftenberg)沙门菌。鼠伤寒沙门菌占据着主要位置。河南省鼠伤寒沙门菌血清型主要有1,4,5,12：i:1,5、1,4,5,12:i:1,2以及1,4,5,12:i:-。特别是1,4,5,12:i:-单H相菌近年来数量日益增多，已逐渐成为鼠伤寒沙门菌常见血清型，这与国内其他省份和欧美等国家的报道一致[5-6]。

3.2细菌耐药是近年来医疗卫生机构面临的重大问题。由于临床过度治疗与抗生素的滥用，病原菌的耐药现象日益严重。从本研究药敏测试结果可以看出，河南省以沙门菌为代表的肠道致病菌耐药问题十分严重，其对8类13种抗生素均存在不同程度的耐药，比较严重的有青霉素类、磺胺类、四环素类、氯霉素类、氨基糖苷类以及一代喹诺酮类，对临床常用药物三代喹诺酮类环丙沙星和诺氟沙星也存在一定的耐药。沙门菌的多重耐药情况也非常严重，临床分离菌株普遍对3～10种抗生素耐药，尤其是这些耐药菌株大多分离自5岁以下的低龄儿童，更值得我们关注。这些多重耐药表型的出现一方面归因于病原菌的自发偶发性耐药突变，但更重要的原因在于抗生素滥用产生的高选择压和耐药基因的水平传递。众所周知，目前细菌耐药在我国和世界范围内都已成为临床和公卫卫生领域高度关注的问题，建立科学有效的细菌耐药监测体系，及时分析分享数据，指导农业、畜牧业和医疗部门合理规范用药，减缓细菌耐药突变和扩散速度，降低临床治疗成本，是一件非常必要和迫切的事情。

3.3脉冲场凝胶电泳是近年来快速发展的传染性病原菌分子分型技术，依托这种技术和网络化实验室实时监测、交换和比对数据，可以及时发现、识别聚集性病例，为食源性传染病早期预测预警，暴发疫情与突发公共卫生事件的调查与现场处置提供了强有力的武器[7]。本研究利用该技术分析了我省鼠伤寒沙门菌PFGE“指纹图谱”特征与优势带型，积累了分子流行病学基线数据并为同其他地区联合开展相应疾病的分子流行病学比对和爆发溯源奠定了基础。我们还注意到部分鼠伤寒沙门菌的耐药表型与PFGE带型呈现聚类一致性，这种现象提示我们基于共同暴露源的菌株往往具有相同的基因和耐药表型特征，这种特征尽管存在变异性和不确定性，但在一定范围内可以成为及早发现聚集性病例的重要指征参数。同时我们也要认识到只有结合病原学和流行病学信息，才能更好的把握疾病传播特点和发挥PFGE技术在疾病防控、突发公卫事件/疫情处置中的作用。

参考文献：

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.012

通讯作者：许汴利，Email：xubl@hncdc.com.cn

中图分类号：R378

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)01-0056-05

Corresponding author:Xu Bian-li, Email:xubl@hncdc.com.cn

收稿日期：2015-04-29；修回日期:2015-08-15

Characteristics of drug resistance and molecular typing research for Salmonella typhimurium isolated in Henan Province, 2011-2013

ZHAO Jia-yong,HUANG Li-li,MU Yu-jiao,XIE Zhi-qiang,SU Jia,ZHANG Bai-fan,XIA Sheng-li,XU Bian-li

(CenterforDiseaseControlandPreventionofHenanProvince,Zhengzhou450016,China)

Abstract:We investigated the antimicrobial resistance and pulsed field gel electrophoresis(PFGE) patterns of S. typhimurium strains in Henan Province isolated in five sentinel hospitals from 2011 to 2013, providing baseline and reference data for the early warning, investigation, traceability as well as antibiotic use strategy. According to molecular typing and Salmonella K-B drug susceptibility testing method published by the international PulseNet bacterial infectious disease monitoring network and USA clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI), we analyzed drug sensitivity and PFGE molecule characteristics of 72 S. typhimurium strains isolated from five sentinel hospitals. Results showed that 72 strains of S. typhimurium had different levels of resistance to 13 kinds of antibiotics, 65 strains were multidrug resistant strains(90.3%), 6 isolates were resistant to 3-5 kinds of antibiotics(8.3%), 34 isolates were resistant to 6-8 kinds of antibiotics(47.2%), 10 isolates were resistant to 9-10 kinds of antibiotics. A total of 72 strains of Salmonella typhimurium were divided into 45 molecular patterns by digestion with XbaI and pulsed field gel electrophoresis. Each pattern contained 1-9 strains with similarity ranged from 65.6%-100%. The situation of drug resistance of clinical isolates of Salmonella in Henan Province was rather serious, PFGE patterns showed both diversity and dominant belt type characteristics. The PFGE patterns of partial strains and its corresponding antidrug spectrum have certain relevance and the same aggregation relationship.

Keywords:S. typhimurium; PFGE; molecular typing; AST

国家科技重大专项《艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治》(No.2012ZX10004201和No.2012ZX10004203)