子宫内膜异位症中Livin和Smac的表达及相关性研究

祝　平，沈树娜

(内蒙古包钢医院妇产科，内蒙古 包头 014010)



子宫内膜异位症中Livin和Smac的表达及相关性研究

祝平，沈树娜

(内蒙古包钢医院妇产科，内蒙古 包头 014010)

[摘要]目的探讨凋亡抑制蛋白家族的新成员Livin、第2个线粒体来源的胱氨酸蛋白酶激活剂Smac在子宫内膜异位症(EMs)中的表达及二者与月经周期、EMs临床分期的关系和相关性分析。方法选取2010年10月至2012年4月在内蒙古医学院第三附属医院妇产科病房因EMs接受腹腔镜手术或开腹手术，并且具有术后病理确诊的EMs患者共60例作为研究组，收集子宫内膜异位症病患的在位内膜、异位内膜组织各30例(增生期各16例，分泌期各14例)，对照组为30例正常内膜组织。采用免疫组化SP法检测出各组标本中Livin、Smac蛋白的表达，并对结果进行统计分析。结果EMs在位、异位内膜组织中Livin的表达强度较对照组显著升高，差异有统计学意义(χ2=12.510，P<0.05)；EMs在位、异位内膜组织中Smac的表达强度均低于正常子宫内膜的表达，差异有统计学意义(χ2=19.530，P<0.05)。在EMs在位内膜和异位内膜组织中，Livin和Smac的表达均与临床分期无关(χ2值分别为0.741、0.002，均P>0.05)；在EMs在位内膜和异位内膜组织中，Livin和Smac的表达呈负相关(rs值分别为-0.933、-0.867，均P<0.05)。结论Livin高表达以及Smac低表达使异位内膜细胞增生及抗凋亡能力加强，导致了EMs的发生及发展。

[关键词]子宫内膜异位症，凋亡抑制蛋白，胱氨酸蛋白酶激活剂，免疫组织化学

子宫内膜异位症(简称内异症，Endometriosis，Ems)指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆内膜及宫体肌层以外的其他部位，卵巢受累最多，其严重危害女性的健康[1]。凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的新成员Livin可通过多种途径来发挥抗细胞凋亡的作用[2]；而第2个线粒体来源的胱氨酸蛋白酶激活剂(second mitochondrial activator of caspase，Smac)可通过阻止IAPs的作用发挥促凋亡作用[3]。本研究对Livin、Smac在EMs中的表达及各因子与月经周期、EMs临床分期的关系进行相关性分析，探讨两者与EMs发生发展的关系，为EMs的临床诊断、治疗及预后评价提供新的理论依据。

1资料与方法

1.1研究对象

选取2010年10月至2012年4月在内蒙古医学院第三附属医院妇产科病房因EMs接受腹腔镜手术或开腹手术，并且具有术后病理确诊的EMs患者60例作为研究组，其中异位内膜组织和在位内膜组织各30例(增生期各16例，分泌期各14例)。研究组中分为EMs异位组和在位组，EMs异位组：年龄21～52岁，按照美国生育协会(American Fertility Society，R-AFS)1985年临床分期标准，Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期16例；EMs在位组：EMs患者通过诊断性刮宫或者子宫切除后得到的在位内膜，子宫内膜的分期是根据各期内膜形态学的特点，同时结合月经史做出判断。随机选取同期因子宫颈病变行子宫切除术患者的子宫内膜，同时未合并子宫腺肌病及EMs行子宫切除手术，术后病理证实为正常子宫内膜的30例患者作为对照组。

所有入选对象具有完整的临床病理资料，术前6个月均未服用过类固醇激素、未放置宫内节育器，子宫内膜无病理改变，月经周期规律，无内分泌疾病史。

1.2实验方法

采用免疫组化SP法进行检验，计数各个视野中阳性细胞的平均百分率，作为该张切片阳性细胞的百分率，然后打分：阳性细胞的百分率>75%为4分，51%～75%为3分，26%～50%为2分，5%～25%为1分，<5%为0分；阳性强度以多数细胞的呈色反应为准：深棕黄色为3分；棕黄色为2分；淡棕黄色为1分；无着色或着色很弱为0分。综合分析判断结果以两者乘积>3分为阳性标准。

1.3统计学方法

应用Excel 2000建立数据库，采用SPSS 16.0软件包统计分析数据。计数资料两组间比较采用χ2检验，相关性检验采用Spearman等级相关分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1凋亡抑制蛋白Livin基因的表达

Livin表达主要在子宫内膜上皮细胞的胞浆内，内膜血管几乎无表达，见图1。

图1　Livin在Ems在位子宫内膜表达(100×)

Livin在对照组、在位组和异位组中的阳性表达差异有统计学意义(χ2=12.510，P<0.05)。在EMs异位内膜、在位内膜中Livin阳性表达均显著高于正常对照组(χ2值分别为11.280、6.690，均P<0.05)；Livin在EMs在位、异位内膜中的阳性表达差异无统计学意义(χ2=0.693，P>0.05)，见表1。无论是EMs研究组还是对照组，Livin的阳性表达在月经的增生期与分泌期差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表2。

2.2第2个线粒体来源的胱氨酸蛋白酶激活剂Smac基因的表达

Smac主要表达在子宫内膜腺体细胞的胞浆内，内膜血管几乎无表达，见图2。

图2Smac在Ems在位子宫内膜表达(100×)

Fig.2 Smac in eutopic endometrium

Smac在对照组、在位组和异位组中的阳性表达差异有统计学意义(χ2=19.530，P<0.05)。在EMs异位内膜、在位内膜中Smac阳性表达均显著低于正常对照组(χ2值分别为19.461、5.554，均P<0.05)；Smac在EMs在位、异位内膜中的阳性表达差异有统计学意义(χ2=5.079，P<0.05)，见表1。Smac在EMs在位、异位内膜中的阳性表达在月经的增生期与分泌期差异均无统计学意义(均P>0.05)，而在正常子宫内膜中月经分泌期的阳性表达高于增生期，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1Livin和Smac在各组中的表达比较

Table 1 Comparison of Livin and Smac expressions among different groups

表2　　Livin和Smac在各组中增生期和分泌期的表达比较

2.3凋亡抑制蛋白Livin基因和第2个线粒体来源的胱氨酸蛋白酶激活剂Smac基因的表达与子宫内膜异位症临床分期的关系

EMs在位内膜中，Livin在Ⅰ～Ⅱ期的表达与在Ⅲ～Ⅳ期之间的表达差异无统计学意义(χ2=0.741，P>0.05)；Smac在Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期之间的表达差异无统计学意义(χ2=0.002，P>0.05)，见表3。

表3 Livin和Smac的表达与EMs临床分期关系的比较

Table 3 Correlation of Livin and Smac expressions with

clinical staging of EMs

2.4凋亡抑制蛋白Livin基因和第2个线粒体来源的胱氨酸蛋白酶激活剂Smac基因在子宫内膜异位症中的相关性

应用Spearman相关分析得出：在EMs在位内膜和异位内膜组织中，Livin与Smac呈负相关，rs值分别为-0.933、-0.867，均P<0.05。

3讨论

3.1凋亡抑制蛋白Livin基因与子宫内膜异位症的关系

IAPs家族的新成员Livin于2000年被发现[4]，其于人类第20号染色体q13.3上，包含7个外显子及6个内含子，全长约4.6kb。Livin蛋白的羧基末端包含1个RING环指结构，由1个组氨酸(Histidine，His)和7个半胱氨酸(Cysteine，Cys)结合了2个锌离子组成；N端包含1个BIR结构域，是一种新型锌指结构，其中含有70个高度保守的氨基酸，BIR结构域可能是Livin基因抗凋亡部位。近年来研究发现子宫内膜中存在凋亡，其周期性的细胞增生及脱落是通过细胞凋亡和增殖失衡来实现的，这种周期性改变被促凋亡基因的水平调控[5]。有研究表明Livin可通过以下3种途径抑制细胞凋亡[6-7]：①Livin可抑制半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶(Cysteine-containing，aspartate-specificpr-oteases，Caspase)-3的活性，同时与未激活的Caspase-9、激活的Caspase-9及Caspase-9前体蛋白相结合，阻断它们依次切割激活，并阻断Caspase-3对Caspase-9前体的正反馈激活，从而产生抗凋亡作用；②Livin可与TAB1(TAK1 binding protein，TAK1蛋白结合蛋白)结合后使TAK1(TGF beta-activated kinase，激活转化生长因子β蛋白激酶)被激活，而TAB1是TAK1的共同活化剂(coactivator)，具有促进丝裂原活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)1的激活作用，从而通过TAB1/TAK1途径激活JNK1对抗细胞发生凋亡；③Livin可阻止化疗药物致使的细胞DNA损毁作用导致的细胞凋亡。本研究结果表明，Livin在EMs异位、在位内膜中的阳性表达显著超过了正常子宫内膜，Livin在前两组内膜中的表达差异无统计学意义。无论是EMs组还是正常对照组，Livin的阳性表达与月经周期及临床分期均无关联。近年来国内外有关Livin在正常内膜及EMs的表达相关报道很少，王春芳等[8]使用免疫组化方法检测了30例正常子宫内膜及30例EMs在位及异位内膜组织中Livin的表达，结果显示Livin在正常组中的表达远低于在位和异位内膜，差异无统计学意义，该实验结果支持本研究结果。目前己发现Livin在多种肿瘤细胞中异常表达，与肿瘤发生关系密切。Livin在正常组织中表达量很少，但可在肺癌、乳腺癌、消化系统恶性肿瘤、膀胱癌、白血病及淋巴瘤等恶性肿瘤组织中高表达。

3.2第二个线粒体来源的胱氨酸蛋白酶激活剂Smac基因与子宫内膜异位症的关系

第2个线粒体来源的胱氨酸蛋白酶激活剂/低等电点IAP直接结合蛋白(Smac/DIABLO蛋白)是2000年在进行HeLa细胞的实验中发现的[9]。人类Smac基因定位于12号染色体的长臂，包含7个外显子，其mRNA全长约1.5kb，编码了239个氨基酸，其中N端55个氨基酸被称为线粒体靶序列(mitochondrial targeting sequence，MTS)，其功能在于使未经加工的Smac蛋白确保定位于线粒体，而在Smac移入线粒体后MTS被线粒体内信号肽裂解，最终生成含有184个氨基酸残基，未加工的Smac蛋白同时获得凋亡活性。成熟的Smac蛋白以二聚体的形式存在于线粒体的膜间隙，当受到凋亡诱导因子如抗癌药物、化学或物理的凋亡信号等的作用时释放入胞浆[3]。Smac因子促进细胞凋亡的机制表现为[10-11]：①Smac的N-末端四肽与Caspase-9 N-末端四肽具有明显的同源性，通过竞争方式解除对Caspase-9的抑制作用，激活Caspase的级联反应，促进细胞凋亡的进展；②Smac可促进Pro-caspase-3裂解，促使其产物p24顺利裂解得到产物p20/p17，后者能够与p12共同构成活化的Caspase-3，而活化的Caspase-3反过来又能激活Caspase-9酶原，形成正反馈通路进一步达到促细胞凋亡作用；③Kim(2005年)研究发现Smac因子促进细胞凋亡可能还存在非Caspase依赖方式，推测该方式可能比依赖Caspase途径的效率更高。本研究结果显示：Smac在正常子宫内膜、EMs在位内膜和异位内膜的阳性表达明显呈降低趋势，组间差异有统计学意义(P<0.05)。Smac在EMs在位和异位内膜中的阳性表达与月经周期及临床分期无关(均P>0.05)，而在正常子宫内膜中月经分泌期的表达高于增生期(P<0.05)。这与子宫内膜在分泌期凋亡加剧以促使内膜剥脱的理论是一致的[12]。

3.3凋亡抑制蛋白Livin基因和第2个线粒体来源的胱氨酸蛋白酶激活剂Smac基因的关系

本研究结果显示，在EMs中Livin和Smac呈负相关。Livin和Smac蛋白均可能通过调节细胞凋亡在EMs的发生中发挥作用，二者可能是EMs发生过程中的重要环节[8]，且二者的协同作用可能促使异位内膜细胞的促凋亡能力减弱，抗凋亡能力增强，导致内膜细胞在异域的增生失控。EMs患者在位和异位内膜细胞凋亡率低、增殖率高，具有生物活性的正常内膜组织细胞随经血逆流入盆腹腔，在盆腔内不发生凋亡反而继续存活、种植，造成了异位病灶在此发生、发展。RNAi技术是新近发展的一种分子生物学技术，该技术与特异的mRNA结合使目的基因瓦解，利用这种沉默特定基因技术，为疾病的基因治疗提供了新的发展方向。

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[专业责任编辑：张冠军]

[收稿日期]2016-01-20

[作者简介]祝平(1980-)，女，主治医师，硕士，主要从事妇产科临床工作。

[通讯作者]沈树娜，主任医师。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.04.017

[中图分类号]R711.71

[文献标识码]A

[文章编号]1673-5293(2016)04-0466-04

Expressions of Livin and Smac and their correlation in endometriosis

ZHU Ping, SHEN Shu-na

(Department of Gynecology and Obstetrics, Inner Mongolia Baogang Hospital, Inner Mongolia Baotou 014010, China)

[Abstract]Objective To explore the expressions of new member of apoptosis inhibiting protein family Livin and second mitochondrial activator of caspase (Smac) in EMs and and analyze the relationship between their expressions and menstrual cycle as well as EMs clinical staging. Methods In the Third Affilated Hospital of Inner Mongolia Medical College, 60 cases of EMs confirmed by pathological results after lapascopic surgery or abdominal surgery were selected in study group. Thirty samples of ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs (16 samples in proliferative phases and 14 samples in secretive phases) were collected in study group and another 30 samples of normal endometrium tissues were collected in control group. The method of immunohistochemistry was used to determine the expressions of Livin and Smac proteins. All statistical analyses were carried out with SPSS16.0 software. Results The expressions of Livin in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs group were significantly higher than in the control group with statistical significance (χ2=12.510, P<0.05). But the expressions of Smac in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs group were significantly lower than in the control group with statistical significance (χ2=19.530,P<0.05). Both in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs group and the control group, the expressions of Livin and Smac were not correlated with clinical staging (χ2 value was 0.741 and 0.002, respectively, both P>0.05). In study group the expression of Livin was negatively correlated with that of Smac both in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs (rs value was -0.933 and -0.867, respectively, both P<0.05). Conclusion The high expression of Livin and low expression of Smac strengthen the ability of hyperplasia of endometrial cells and antiapoptotic capacity, which leads to the occurrence and development of EMs.

[Key words]endometriosis (EMs); inhibitor of apoptosis proteins (IAPs); second mitochondrial activator of caspase (Smac); immunohistochemistry