枸杞多糖含量测定方法的比较分析

李良，金文娟（武汉天龙黄鹤楼酒业有限公司，湖北武汉430070）



枸杞多糖含量测定方法的比较分析

李良，金文娟
（武汉天龙黄鹤楼酒业有限公司，湖北武汉430070）

摘要：利用紫外分光光度计，采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品，对比苯酚-硫酸法（方法Ⅰ）、《中国药典》中方法（方法Ⅱ）及改进后的苯酚-硫酸法（方法Ⅲ），在485nm处测定枸杞多糖的含量，比较3种方法的优劣。试验表明：3种方法标准曲线相关系数分别为0.930 9、0.991 8、0.996 8；吸光值稳定性RSD值分别为10.95%、2.13%、0.13%；回收率试验中方法Ⅲ的相对误差较小，无显著差异。可见方法Ⅲ最优。

关键词：枸杞多糖；分光光度计法；比较分析

枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide）是从枸杞子中提取的一种水溶性多糖，具有降血脂、降血糖、保肝、抗肿瘤、抗衰老等多种生理功能［1-2］，其含量常作为评价某些中药材及中药制剂质量的重要指标［3］；罗琼等［4］以纯枸杞多糖研究表明其显示出比粗枸杞多糖有更明显的免疫增强效应；王柏昆等［5］实验证明10 mg/kg枸杞多糖对荷瘤小鼠抑瘤率达31%；衣艳君［6］发现，枸杞子多糖能有效降低高脂血症大鼠血清中TC含量，具有明显的降血脂功能，调节脂类代谢的功能；陈立群等［7］研究发现，较高浓度的枸杞多糖能够使链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠受损胰岛β细胞得到恢复，胰岛素分泌增加，血糖浓度降低，对STZ所致糖尿病大鼠具有较好的治疗作用。边纶等［8］实验结果表明，枸杞多糖对四氯化碳引起的肝损伤有修复作用，并促进肝细胞再生。

枸杞多糖由于具有重要的生物学功能，因此，多糖的检测方法也备受关注。付艳丽等［9］针对枸杞多糖含量进行研究，于室温下反应15 min后，静置于室温，在490 nm波长处测定枸杞多糖含量；《中国药典》中枸杞多糖含量的测定方法是：于40℃水浴中保温15 min后，静置至室温后，在490 nm波长进行检测；任一平［10］对香菇多糖产品简易预处理，选用硫酸钠溶液作为流动相，在示差折光检测器下检测，选择右旋糖酐为标准物质，用外标法完成了香菇多糖的含量测定。

本文中枸杞多糖的测定方法采用苯酚-硫酸法。利用紫外分光光度法测定其含量，《中国药典》及相关文献［11］均有此方法的记载，但经过多次试验，其吸光值极不稳定，给标准曲线的制作和后期定量测定带来困难。本试验按照《中国药典》和相关文献［11］中枸杞多糖的检测方法，对反应温度、反应时间及反应终止方法进行优化，以标准曲线相关系数，吸光值的稳定性及回收率的比较，得到最佳的试验方法。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

枸杞多糖提取物：枸杞多糖含量30%、50%，西安和霖生物有限公司；葡萄糖标准品：HPLC≥98%，中国生物制品检定所；苯酚、浓硫酸：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

UV-2700紫外可见分光光度计：岛津企业管理（中国）有限公司；ME3002E电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1试验原理

本试验采用苯酚-硫酸法测枸杞多糖的含量。苯酚-硫酸法由Dubois等［12］建立，其原理是利用浓硫酸将多糖水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，再和苯酚缩合成有色化合物，用紫外分光光度法测定其含量。此法灵敏度高、显色较稳定，是枸杞多糖最常用的检测方法。但由于对反应温度、反应时间及反应终止方法缺乏统一标准，《中国药典》及各文献记载［13-14］的处理方法也不尽相同，本试验研究了不同的处理方式对多糖含量测定结果的影响，其中方法Ⅰ参照文献［11］，方法Ⅱ根据《中国药典》中的方法［3］，方法Ⅲ是改进的方法。

苯酚-硫酸法（方法Ⅰ）：添加完浓硫酸后，室温反应15 min后，静置至室温后，紫外可见光分光光度计下进行检测。

《中国药典》测定方法（方法Ⅱ）：参照《中国药典》中枸杞多糖含量的测定方法，添加完浓硫酸后，置40℃水浴中保温15min，取出，静置至室温后进行检测。

改进苯酚-硫酸法（方法Ⅲ）：添加完浓硫酸后，沸水浴中反应15 min，取出立即进行冰水浴（水温0℃左右），冷却至室温后进行检测。

1.2.2枸杞多糖溶液的配制

称取40 mg枸杞多糖50%的提取物于50 mL烧杯中，加水溶解，定容至100 mL，摇匀备用。

1.2.3溶液的配制

1.2.3.15%苯酚溶液的配置

60℃水浴使苯酚溶解，加少量蒸馏水隔绝空气，精密吸取苯酚溶液5 mL至100 mL棕色容量瓶中，加水定容至刻度。

1.2.3.2对照品溶液的制备

精密称取105℃烘至恒重的葡萄糖对照品50 mg 至100 mL小烧杯中，加适量水溶解，移至500 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL中含无水葡萄糖0.1 mg）。

1.2.4最佳吸收波长扫描

以10 μg/mL的标准品为样品，用方法Ⅱ中处理方法，在波长为400 nm～800 nm间做全波长扫描，与文献报道［11］的枸杞多糖测定的最大吸收波长490 nm左右作对比，确认其最大吸收波长。

分别吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL葡萄糖对照品溶液，注为0#、1#、2#、3#、4#、5#，补水至2.0 mL，加5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速垂直加入5.0 mL浓硫酸，振荡5 min后，按照3种不同的反应温度、反应时间及不同的反应终止方法进行处理，在最大吸收波长下，用紫外分光光度法测其吸光值，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.6吸光值稳定性的比较

为了检验3种不同的处理方法对吸光值的稳定性。分别以3种方法中5#（10 μg/mL的标准品）为试验样品，每隔30 s测定一次吸光值，共测定10次，计算其RSD值，比较3种方法吸光值的稳定性。

1.2.7回收率测定

用方法Ⅲ中的标准曲线分别对已知含量为30%、50%的枸杞多糖及葡萄糖标准品（HPLC≥98%）进行测定。每组样品平行检测6次，计算其平均值与相对误差。

2　结果与讨论

2.1最佳吸收波长确定

根据文献资料［11］及枸杞多糖检测试验原理可知，反应形成的显色化合物在490 nm左右的波长下有最大吸收值，通过对400 nm～800 nm做全峰值扫描级峰值检测，扫描图谱如图1所示。

一个月后，出差回来的郭启明打开电脑上网，发现有人在QQ上给自己留言：“没有想到风度翩翩的郭总还稀罕老婆？如果你乐意的话，我就凑合凑合吧！”这样的直白和挑衅，让郭启明顿时产生了莫名其妙的好感。她到底是谁呢？哪有女孩子这么主动的？他不禁想与这个女孩说说话。

图1　葡萄糖标准品反应最佳吸收波长扫描图Fig.1　Optimum absorption wavelength scan of glucose standard reaction

由图1可知，标准品在485 nm下有最大吸收波长，同时对比文献资料［11］所述最大吸收波长在490 nm左右，可知，最大吸收波长为485 nm。

2.2多糖测定标准曲线的绘制

标准品在同种浓度下，用3种不同的方法处理后，所检测的吸光值见表1。

表1　3种方法浓度及吸光值Table 1　Concentration and absorbance value of three methods

由表1可以看出，标准品在同种浓度下，3种方法所得的吸光值不同。其中方法Ⅲ所得标准曲线方程为y=0.049 3x+0.014 3，相关系数R2=0.996 8，标准曲线见图2，相关系数最高，回归性最好。

2.3三种方法吸光值稳定性的比较

以10 μg/mL的标准品为样品，用3种方法分别在不同时间测定其吸光值，每隔30 s测定一次，共测定10次，比较3种方法吸光值的稳定性，计算其RSD值，见表2。

图2　采用方法Ⅲ得到的标准曲线Fig.2　The standard curve using by methodⅢ

表2　3种方法吸光值稳定性的比较Table 2　Light absorption value stability comparison of the three methods

以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法测多糖含量时最关键的环节是反应后的显色。有报道认为，影响显色的重要因素是水浴温度和水浴放置时间［15-16］。

通过3种显色处理方法结果可知，根据《药物分析》中要求，重复性仪器精密度中紫外RSD值≤5%，方法精密度RSD值≤3%，根据RSD值比较可知：

方法Ⅰ于室温下静置，反应进行不完全，吸光值稳定性较差，因而对标准曲线的绘制也有较大影响，曲线相关系数也较差。

方法Ⅱ虽然是《中国药典》中引用的标准方法，但是笔者在试验过程中发现，由于反应后快速检测，并没有进行冰水浴，所以并没有对反应进行终止，也会影响试验结果。

而笔者改进过的方法Ⅲ采用沸水浴加热，因其能促使缩合反应更为完全，反应后立即进行冰水浴及时终止反应，由于其吸光值趋于稳定，变化幅度较小，曲线相关系数也较好。

三种方法吸光值趋势图见图3。

图3　三种方法吸光值趋势图Fig.3　Light absorption value trend graph of the three methods

根据图3三种方法吸光值趋势图也可看出，方法Ⅲ的吸光值最为平稳，变化幅度小，稳定性较好。

2.4回收率测定

回收率的测定见表3。

表3　回收率的测定Table 3　Test of recovery

用方法Ⅲ中的标准曲线分别对已知含量为30%、50%的枸杞多糖及葡萄糖标准品（HPLC≥98%）进行测定，检验其准确性，由6次平行试验，得平均值为分别为30.03%、50.05%、98.21%，相对误差分别为0.10%、0.04%、0.21%，说明由方法Ⅲ得到的标准曲线对多糖含量的测定具有较好的准确性。

3　结论

利用紫外分光光度计，采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品，对比方法Ⅰ、方法Ⅱ及方法Ⅲ，在485 nm处测定枸杞多糖的含量。结果表明：3种方法标准曲线相关系数分别为0.930 9、0.991 8、0.996 8；吸光值稳定性RSD值分别为10.95%、2.13%、0.13%；采用方法Ⅲ，以3种已知含量样品做回收率试验，3种样品中方法Ⅲ的相对误差分别为0.10%、0.04%和0.21%，无显著差异。

试验证明，方法Ⅲ最优。即先沸水浴15 min，利用硫酸将枸杞多糖分解为单糖，迅速脱水生成糠醛衍生物，再和苯酚缩合成有色化合物，反应趋于完全后，立即进行冰水浴，使反应终止，放至室温后测定其吸光值，可增加稳定性，提高准确度，增强可操作性。

参考文献：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.033

基金项目：武汉市汉阳区科技创新项目

作者简介：李良（1982—），男（汉），工程师，硕士研究生，主要从事饮料、酒类研发及产业化。

收稿日期：2015-05-11

Comparative Analysis Methods of Lycium barbarum Polysaccharide Content Determination

LI Liang，JIN Wen-juan

（Wuhan Pride Yellow Crane Tower Distillery Co.，Ltd.，Wuhan 430070，Hubei，China）

Abstract：Using the phenol-sulfuric acid method，with glucose as the standard by UV spectrophotometer and comparison of phenol-sulfuric acid method（methodⅠ），the method in China Pharmacopoeia（methodⅡ）and the method improved（methodⅢ），the content of Lycium barbarum polysaccharide was detected under 485 nm to compare the advantages of the three methods.Experiments showed that the three methods standard curve cor relation coefficient were 0.930 9，0.991 8，0.996 8，RSD of light absorption value stability were 10.95%，2.13%，0.13%；the relative error of recovery rate of methodⅢwas small，which showed no significant difference.It meant that the methodⅢwas the best.

Key words：Lycium barbarum polysaccharide；spectrophotometric method；comparative analysis