汉中毛竹叶黄酮提取及抗氧化稳定性研究

史娟，李江，葛红光（陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西汉中723000）



汉中毛竹叶黄酮提取及抗氧化稳定性研究

史娟，李江，葛红光
（陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西汉中723000）

摘要：以汉中毛竹叶为原料，采用超声波预处理-乙醇回流法提取竹叶黄酮。在不同的液固比、乙醇浓度、回流温度和回流时间下，探讨最佳提取工艺；并对黄酮的抗氧化稳定性进行研究。研究结果表明，当料液比为1∶30（g/mL），乙醇浓度为70%，回流温度为70℃，回流时间为120min时，竹叶黄酮提取率最高为2.917%。抗氧化试验表明，pH、光照时间、Cu2+、Zn2+以及Al3+对抗氧化能力影响较大，金属离子Na+、Ca2+、Mg2+对竹叶黄酮清除DPPH自由基（二苯代苦肼基自由基）的能力影响相对较小。

关键词：竹叶；黄酮；提取；抗氧化；稳定性

毛竹，禾本科刚竹属，又名“楠竹”、“孟宗竹”等，在秦岭、汉水流域、长江以南和台湾省及黄河流域多见栽培。汉中地处秦巴山区，植被种类丰富，气候、土壤情况适合楠竹种植。现有楠竹资源丰富，并计划打造西北最大竹海，完成500万亩楠竹种植，未来将有丰富的竹资源可用于开发。竹叶在我国具有悠久的食用和药用历史，有效成分包括黄酮、酚酮、蒽醌、内酯、多糖、氨基酸、微量元素等［1］。已有文献表明竹叶黄酮具有作为天然抗氧化剂的开发潜力［2］，金毛竹叶提取物可显著抑制由AAPH（偶氮二异丁脒盐酸盐）诱导的脂质体的过氧化［2-3］；竹叶黄酮还具有较好的调节血脂作用［4-5］；食物或饮品等中加入竹叶提取物，可使其抗氧化性能和储存稳定性大大增强［6-7］。又因竹叶黄酮类化合物原料来源丰富、食用安全性高且具有清新甜香的竹子风味，故在天然功能性食品添加剂及医药保健品领域具有较好前景［8］。本研究以竹叶为原料，以单因素与正交试验考察提取条件对竹叶竹叶黄酮的得率的影响，并对其抗氧化稳定性进行研究，为汉中地区竹叶资源的开发利用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜竹叶：采自汉中楠竹园；芦丁对照品：中国药品生物制品检定所；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基）：美国Sigma－Aldrich公司。

无水乙醇、石油醚、亚硫酸钠、硝酸铝、浓盐酸、氢氧化钠、氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化铜、氯化锌、氯化铝及其它试剂均为分析纯。

1.2主要仪器

DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；FW117粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；AL204-IC型电子分析天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；SB-200DT超声波清洗机：宁波新芝生物科技有限公司；RE-2A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；TDL-5台式离心机：上海安亭科学仪器厂；721型分光光度计、PHS-3S型pH酸度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1竹叶的前处理

将竹叶用自来水洗净、沥干，置于烘箱，60℃下烘干并用研钵研细，密封备用。

1.3.2竹叶黄酮提取流程

称取一定质量的竹叶粉末，加入一定浓度乙醇为提取溶剂，超声波预处理30 min后（超声功率700 W、频率100 kHz），在一定液料比、温度条件下提取一定时间，抽滤，滤液浓缩后加入蒸馏水，除去水不溶性杂质，再次过滤，加入石油醚萃取，收集下层为样品提取液，加蒸馏水定容后，待测。

1.3.3标准曲线的绘制及回归方程的建立

精确称取芦丁标准品7.5 mg，加入乙醇定容至50 mL，配成0.15 mg/mL的芦丁标准溶液。准确吸取标准品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，移入10 mL刻度比色管中，加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀后放置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀后放置6 min；加入4%氢氧化钠溶液2 mL，乙醇定容至刻度，10 min后在510 nm处测定不同浓度芦丁的吸光度。用最小二乘法做线性回归，得芦丁浓度C（mg/mL）与吸光度A的回归方程式：A=17.519C-0.011，R2= 0.999 3，芦丁浓度与吸光度有良好的线性关系。

1.4竹叶黄酮提取的单因素试验

以竹叶黄酮提取率为指标分别考察液固比、乙醇浓度、回流温度和回流时间4个因素对提取率的影响，每个因素设定5个梯度，进行单因素试验，各单因素试验重复3次，并取平均值。

1.5竹叶黄酮提取的正交试验设计

参照单因素试验结果，设计L9（34）试验以确定竹叶黄酮提取的最佳工艺条件，各因素水平的设定如表1所示。

表1　L9（34）正交试验因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal experiments

1.6竹叶黄酮抗氧化稳定性试验

1.6.1竹叶黄酮对DPPH自由基的活性测定

采用清除DPPH自由基（二苯代苦肼自由基）的能力，测定竹叶黄酮抗氧化活性［9］。测定时，将待测竹叶黄酮试样配制成系列溶液，测定各浓度竹叶黄酮试样对DPPH自由基清除率。并以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图，得到竹叶黄酮浓度与自由基清除率的关系。

1.6.2竹叶黄酮抗氧化稳定性

在510 nm波长下，通过测定竹叶黄酮在不同温度、pH值、金属离子等条件下吸光度值的变化，对其抗氧化活性的稳定性进行研究。

1.7数据分析

试验数据均为3次重复，取平均值，数据分析采用Origin8.0软件。

2　结果与分析

2.1单因素对竹叶黄酮提取效果的影响

2.1.1最佳料液比的确定

准确称取竹叶粉末2 g，按1.3.2超声预处理后，固定提取温度为80℃，以70%乙醇为溶剂，改变料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）的回流提取60 min后，测定吸光度，研究料液比对竹叶黄酮提取率的影响，见图1。

图1　 料液比对黄酮提取率的影响Fig.1　Effect of material/liquid ratio on flavone yield

由图1结果发现料液比1∶25（g/mL）时，样品提取测得的吸光度最大。当料液比较大时，提取率低的原因是溶剂用量少，原料浸润不完全，故而影响提取效果；而溶剂过多则会吸收超声波辐射能量，因而影响多糖的析出，且易导致其他组分同时析出，从而影响产率。

2.1.2最佳乙醇浓度的确定

同于2.1.1提取方法，称取5份相同质量（2.0 g）竹叶粉末，分别加入浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇50 mL，80℃下回流提取60 min，并测定黄酮含量。乙醇浓度对黄酮提取率的影响见图2。

图2　乙醇浓度对黄酮提取率的影响Fig.2　Effect of ethanol concentration on flavone yield

图2结果发现乙醇浓度70%时，样品提取率最大，因此以70%的乙醇为最佳提取浓度。

2.1.3最佳回流温度的确定

以70%乙醇为提取溶剂，按照1∶25（g/mL）料液比，分别在60、65、70、75、80℃的温度下，回流竹叶样品60 min，测定含量，结果见图3。

图3　提取温度对黄酮提取率的影响Fig.3　Effect of extraction temperature on flavone yield

图3结果发现，提取温度70℃时，样品提取测得的吸光值最大，因此以70℃的提取温度最佳。

2.1.4最佳回流时间的确定

取2.0 g竹叶样品5份，加入70%乙醇50 mL，超声预处理后，在70℃下分别回流提取30、60、90、120、150 min，测定黄酮含量，结果见图4。

图4　提取时间对黄酮提取率的影响Fig.4　Effect of extraction time on flavone yield

图4结果表明，随着提取时间的增长，竹叶黄酮的提取率逐渐上升，在90 min～120 min时基本达到最大值。考虑到90 min和120 min差别不大，黄酮的溶出已达到平衡；继续延长时间，可能导致黄酮类结构被破坏，提取率降低，所以90 min为提取适宜时间。

2.2竹叶黄酮提取效果的正交试验结果

2.2.1正交试验结果

采用超声波预处理-乙醇回流法提取竹叶黄酮，对影响提取效果的主要因素：料液比、乙醇浓度、回流温度、回流时间进行四因素三水平的正交试验。以黄酮的提取率为考察指标，结果见表2。

由表2极差分析结果可知，4个因素对黄酮提取率的影响大小依次为：回流时间＞乙醇浓度＞回流温度＞液固比，最佳组合为A3B2C2D3，即料液比为1∶30（g/mL），乙醇浓度为70%，回流温度为70℃，回流时间为120min。

2.2.2验证性试验

为进一步考察上述优选工艺的稳定性，在上述最佳条件下，进行3次平行试验。用紫外分光光度法测定其吸光度，并计算出黄酮类物质浸出率最高，为2.917%。

2.3竹叶黄酮清除DPPH自由基能力

采用清除DPPH自由基的能力，测定竹叶黄酮抗氧化活性，结果如图5所示。

表2　正交试验结果Table 2　Orthogonal test design and results

图5　 竹叶黄酮对DPPH自由基清除的能力（n=3）Fig.5　Scavenging ability of flavone from bamboo leaf

在设定的浓度范围内，竹叶黄酮清除自由基的能力与样品浓度具有较好浓度-效应依赖关系。拟合方程为Y=0.131 4C+23.225（R2=0.997）。

2.4竹叶黄酮抗氧化稳定性

2.4.1pH对竹叶黄酮抗氧化稳定性的影响

取等体积（5 mL）质量浓度为200 μg/mL的竹叶黄酮溶液6份，分别置于6个小烧杯中，用稀盐酸和氢氧化钠溶液调整pH为2、6、7、8、10、12。室温下放置2h后，取样测定其对DPPH自由基的清除率，见图6所示。

图6　pH对竹叶黄酮清除DPPH自由基的影响Fig.6　Effect of pH on antioxidant stability of flavone from bamboo leaf

在图6中，竹叶黄酮的抗氧化能力在pH=6时最强。随着pH降低，即酸性增强，黄酮对DPPH自由基的清除率降低，这是因为黄酮在酸性条件下形成烊盐，致使其抗氧化能力降低。碱性条件下，竹叶黄酮DPPH自由基清除率下降更为迅速，pH=12时，清除率仅为33.7%，这主要因为碱性条件下，黄酮类化合物结构中所含酚羟基被破坏，而导致抗氧化活性降低。

2.4.2光照对抗氧化稳定性的影响

光照对抗氧化稳定性的影响见图7。

图7　 光照对竹叶黄酮清除DPPH自由基的影响Fig.7　Effect of light on antioxidant stability of flavone from bamboo leaf

由图7可知，光照对竹叶黄酮清除DPPH自由基能力有较大影响。随着光照时间的延长，清除率几乎成直线减弱；在光照12 d后下降至45.1%。光照试验前后，清除率下降达接近一半；而未光照样品的对照组，清除率下降较少。这是因为竹叶黄酮类化合物结构中的多含有酚羟基，光照下易被氧化，从而导致其抗氧化性减弱。

2.4.3金属离子对抗氧化稳定性的影响

金属离子对抗氧化稳定性的影响见表3。

表3　金属离子对竹叶黄酮清除DPPH自由基的影响Table 3　Effect of metal ions on antioxidant stability of flavone from bamboo leaf

从表3可看出，不同金属离子在相同的浓度下，对竹叶黄酮清除DPPH自由基的作用区别较大。其中，Na+对抗氧化活性影响最小；Mg2+、Ca2+对抗氧化活性影响处在中间位置；而Zn2+、Cu2+、Al3+的影响较大，特别是Al3+影响最为严重。这可能与黄酮类化合物结构中所含酚羟基或羰基，易与某些金属离子进行络合致使其性质发生改变，从而降低了抗氧化活性。金属离子不同，配位能力也不同，从而表现出其对抗氧化能力的影响区别较大。

3　结论

以汉中产毛竹鲜竹叶为原料，经超声波预处理-乙醇回流法对竹叶黄酮进行提取，得到最佳提取工艺是料液比为1∶30（g/mL），乙醇浓度为70%，回流温度为70℃，回流时间为120 min时，竹叶黄酮提取率最高为2.917%。通过清除DPPH自由基法测定竹叶黄酮的抗氧化活性，研究不同条件下黄酮抗氧化稳定性。研究结果表明，3种金属离子Na+、Ca2+、Mg2+对竹叶黄酮清除DPPH自由基的能力影响不大；而金属离子Cu2+、Zn2+、Al3+以及pH、光照时间对抗氧化能力影响较大。因此，在对竹叶黄酮的制备和使用过程中，应避免强酸、强碱、强光条件下保存；同时要注意避免与一些高浓度金属离子Cu2+、Zn2+及Al3+的接触。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.013

基金项目：国家自然科学基金（21373132）

作者简介：史娟（1978—），女（汉），副教授，博士研究生，研究方向：天然产物化学和有机合成。

收稿日期：2015-05-04

Extraction of Flavone from Bamboo Leaf of Hanzhong and Their Antioxidant Stability

SHI Juan，LI Jiang，GE Hong-guang

（School of Chemistry and Environment Science，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，Shaanxi，China）

Abstract：The extraction process of flavone in bamboo leaf from Hanzhong assisted by ultrasonic wave pretreatment was studied.The flavone extraction from the different solid-to-liquid ratio，ethanol concentration，extraction temperature and extraction time were studied.And the antioxidant stability of flavone was assessed by its capacity to scavenge the DPPH free radical under different treatments.The results showed that the best extraction process condition was：the ratio of solid to extracting liquid 1∶30（g/mL），ethanol concentration 70%，abstracting temperature 70℃and abstracting time 120 min.The results of anti-oxidant activities showed that pH，illumination and metal ions（Cu2+，Zn2+，Al3+）had a bigger influence to the antioxidation stability of flavones.The metal ions Na+，Ca2+，Mg2+did not produce a great a reduction of scavenging capacity.

Key words：bamboo leaf；flavone；extraction；antioxidan；stability