蓝莓果酒对秀丽隐杆线虫寿命的影响

曾敏，魏焘，李柯，王传花，陈稠薇，王远亮

（湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128）



蓝莓果酒对秀丽隐杆线虫寿命的影响

曾敏，魏焘，李柯，王传花，陈稠薇，王远亮*

（湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128）

摘要：探讨蓝莓果酒延缓秀丽隐杆线虫寿命的活性物质。以秀丽隐杆线虫为模式生物，喂食原花青素（proanthocyanidin，PC）（0、1、2、3、4、5mg/mL）和食用乙醇（0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%）的蓝莓果酒，测定线虫寿命、生殖能力和运动能力。与对照组比较，酒精度14%、不同浓度的原花青素的蓝莓果酒对线虫寿命均具有延缓作用，3 mg/mL浓度后线虫寿命延长（P＜0.05）；对生殖能力和运动能力均有不同程度的增强效果（P＜0.05），但5 mg/mL后，效果不明显；喂食原花青素3mg/mL、不同酒精度的蓝莓果酒的线虫寿命均会缩短，其作用与酒精度呈正相关关系，生殖能力和运动能力均有不同程度的减弱。蓝莓果酒中的原花青素具有延缓线虫寿命的作用，浓度在3 mg/mL到5 mg/mL作用明显；酒精的影响会随着添加浓度的增加而加速线虫的死亡。

关键词：秀丽隐杆线虫；蓝莓果酒；原花青素；酒精；衰老

目前，已经确定蓝莓果酒的主要功能成分为原花青素，是一种缩合单宁，广泛存在于各种植物的核、皮或种籽等部位［3-5］的多酚化合物。关于原花青素的研究较多，如王艳菊［6］等以寿命为试验终点研究了葡萄籽原花青素对秀丽隐杆线虫寿命的影响，发现了原花青素具有延缓线虫寿命的作用，该试验结果可间接证明以原花青素为功能成分的产品具有延缓衰老的特性。但并无研究直接证明蓝莓果酒具有延缓衰老的作用。目前，国内外对于蓝莓果酒的研究，主要是针对蓝莓果酒主要成分及蓝莓果酒发酵工艺的研究。如陈健［7］等对蓝莓花青素抗氧化进行了研究，发现蓝莓花青素有较好的清除DPPH自由基的能力；Jin Gook KIM等［8］也对蓝莓果酒的主要原料蓝莓果实品质、花青素、总酚含量和抗氧化做了详细的研究。李立功等［9］采用发酵法生产蓝莓果酒的最佳配方及生产工艺，探索蓝莓果酒发酵最佳工艺；杨曙方等［10］重点研究了蓝莓果酒主发酵工艺。本研究选取国际上公认的在延缓衰老研究领域中具有优势的主要模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称线虫）作为研究对象，以整体动物寿命试验作为检测手段［11］，测定喂食蓝莓果酒的线虫平均寿命、产卵数、头部摆动频率和身体弯曲频率，确定蓝莓果酒对线虫寿命的影响。

1　材料与方法

1.1菌株和线虫

菌株E.coli OP50、野生型秀丽隐杆线虫Bristol （N2）：东南大学。

1.2仪器和试剂

蓝莓果酒（酒精度14%，总糖115.71 g/L，挥发酸0.64 g/L，原花青素3 360.63 mg/mL）；PC标准品（纯度≥95%）：成都曼斯特生物科技有限公司；食用乙醇：天津市大茂化学试剂厂；MJX-250B-Z电热恒温培养箱：上海博迅试验有限公司；Motic SMZ-168连续变倍体式显微镜：麦克奥迪实业集团有限公司；SW-CJ-1FD单人单面超净工作台：苏州净化仪器厂。

1.3试验方法

1.3.1线虫培养

采用Brenber［12］的方法，将雌雄同体线虫饲养于涂布大肠杆菌OP50（E.coli OP50）线虫标准培养基（Nematode Growth Medium，NGM）上，NGM配制：3 gNaCl，2.5 g胰蛋白胨，17 g琼脂粉，加入975 mL蒸馏水，加入5 mg/mL胆固醇溶液（无水乙醇配制）1 mL，在121℃、30 min高压灭菌后在无菌条件下加入 1 mol/mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液25 mL（121℃、30 min高压灭菌），抽滤灭菌的1 mol/mLMgSO41 mL，1 mol/mL CaCl21 mL。培养温度20℃，观察线虫生长情况，定期将线虫转至新的E.coli OP50的NGM培养基中。

1.3.2线虫同期化

秀丽线虫同期化培养，由于雌雄同体的秀丽隐杆线虫在L3期体内已经储存有大量的卵子，所以到L4期时雌雄同体的秀丽隐杆线虫不需要交配就可以直接繁殖出后代。提取20条处于L4期的雌雄同体的秀丽隐杆线虫至涂有E.coli OP50的NGM培养基平板上，在20℃恒温条件下培养。一般1 h内产卵6个～8个，2 h后将成虫挑走，将平板置于20℃培养箱内培养，48 h～50 h后便可得到同期化的秀丽隐杆线虫，用于试验。

1.3.3寿命统计

第一步制作试验平皿，方法参照［13］，即选用9 cm的培养皿，按每培养皿15 mLNGM培养基制作平板，待琼脂凝固后，将100 μLOP50菌液均匀涂布约平板2/3，放置于20℃恒温培养箱培养24 h，待平板形成菌膜。试验开始前，待测试液均匀涂布于菌膜表面，试液添加量为200 μL。第二步培养秀丽隐杆线虫，方法参照文献［14］，具体操作步骤如下：同期化秀丽隐杆线虫生长至L4期时，将秀丽隐杆线虫挑至制作好的试验平板中，对照试验为只含OP50的NGM平板，每组线虫数量均为10±1条，放置于20℃恒温培养箱培养。第2天观察线虫是否死亡，并将存活的线虫转移至新平板（制作与初始平板方法相同），并准确记录下当天线虫死亡和丢失数目，直至线虫全部死亡。确认线虫死亡的标准是线虫对外部刺激无应答或显微镜下观察不咽食。所有受试线虫从卵开始生长记为第0天，对照组和各个试验组最后一条线虫死亡时间即为该组线虫的最长寿命。

a试验：用酒精度14%、原花青素质量浓度分别为1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg/mL的蓝莓果酒喂养秀丽隐杆线虫，对照组为只含OP50的NGM平板和14%乙醇水溶液，喂食量均为200 μL，统计秀丽隐杆线虫寿命。

b试验：用原花青素浓度3.00 mg/mL、酒精度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%的蓝莓果酒喂养秀丽隐杆线虫，对照组为只含OP50的NGM平板和原花青素浓度3.00 mg/mL水溶液，喂食量均为200 μL，统计线虫寿命。

1.3.4生殖能力

参照文献［15］中的方法，依据试验需要做相应改动。本试验选用直径为6 cm的培养皿进行试验，试验NGM平板制作参照1.3.3，NGM培养基添加量为5 mL，OP50菌液涂布量为30 mL，均匀涂布平板2/3，待测试液量为70μL，均匀涂布菌膜表面。当同期化秀丽隐杆线虫生长至L4期时挑至制作好的试验平板，每平板1条线虫，后放置于（20±2）℃培养24 h，第2天转至新平板（制作初始平板方法相同），并在显微镜下观察前1天平板上的虫卵数量，记录数据。直至线虫产卵完全结束。

a试验与b试验试验组和对照组设计与1.3.3相同，喂食量为200 μL。

1.3.5运动能力

参照文献［16］，并作相应改动，试验平板制作方法同1.3.3。试验时，将同期化后L4期线虫挑至平板中，每板数量为（15±2）条，放置20℃恒温培养箱培养24 h，第二天进行观察。观察方法如下：挑取状态相当的受试线虫至新的NGM平板（无OP50）后，让线虫自由运动2 min，然后记录1 min内线虫头部摆动的数目作为头部摆动频率指标，1次头部摆动定义为线虫头部从一侧摆向另一侧后，再摆回来。记录在20 s内身体弯曲的数目作为身体弯曲频率指标。1次弯曲定义为线虫相对于身体长轴方向上1个波长的摆动。

a试验与b试验试验组和对照组设计与1.3.3相同，喂食量为200 μL。

1.4统计学分析

平行试验3组，试验数据采用SPSS Statistics 19.0 （IBM）统计分析，所有数据都以平均值±标准差表示，组间比较采用VNOVA分析。

2　结果与分析

2.1不同成分蓝莓果酒对秀丽隐杆线虫的影响

喂食不同原花青素质量浓度的蓝莓果酒的结果见表1。

表1　不同原花青素质量浓度的蓝莓果酒秀丽隐杆线虫的寿命Table 1　Lifespan of C.elegans in different PC concentrations' blueberry wine

从表1得知，原花青素0 mg/mL蓝莓果酒组相对于OP50组秀丽隐杆线虫的寿命较显著下降。与OP50组相比，喂食不同质量浓度原花青素蓝莓果酒的秀丽隐杆线虫寿命均有所延长，其中1 mg/mL组秀丽隐杆线虫平均寿命提高了0.8 d，2 mg/mL组提高了0.9 d，3、4、5 mg/mL组分别提高了1.97、2.2、3.1 d。

原花青素对秀丽隐杆线虫寿命的影响见图1。

图1　不同原花青素质量浓度的蓝莓果酒秀丽隐杆线虫生存曲线Fig.1　Survival curves of C.elegans in different PC concentrations' blueberry wine

由图1可看出秀丽隐杆线虫的全程生存情况，OP50对照组生存曲线相对于0 mg/mL对照组右移明显；与OP50组相比，喂食蓝莓果酒的秀丽隐杆线虫各个试验组的生存曲线均有右移，且原花青素各质量浓度间间隔差异显著，但低浓度（1、2 mg/mL）组与OP50对照组相比，偏移距离不显著。以上结果说明蓝莓果酒中原花青素在延缓秀丽隐杆线虫衰老，延长秀丽隐杆线虫寿命上有较明显的效果。

喂食不同酒精度的蓝莓果酒的结果见表2。

表2　不同酒精度的蓝莓果酒秀丽隐杆线虫寿命Table 2　Lifespan of C.elegans in different alcohol concentrations' blueberry wine

从表2得知，喂食原花青素质量浓度为3 mg/mL，不同酒精度的蓝莓果酒，秀丽隐杆线虫寿命均显著低于0%组（P＜0.05），且随着喂食酒精浓度的升高，试验组的秀丽隐杆线虫寿命变化不明显，说明酒精对秀丽隐杆线虫寿命的损伤能力有所降低。

酒精对秀丽隐杆线虫寿命的影响见图2。

结合表2和图2综合分析。表2可看出，0%对照组与OP50对照组秀丽隐杆线虫在平均寿命上没有明显差异（P＞0.05），但从图2可知，0%对照组秀丽隐杆线虫在生长后期，其生存曲线处于OP50组生存曲线上方，说明单一原花青素喂养秀丽隐杆线虫也能延长秀丽隐杆线虫寿命。

原花青素对秀丽隐杆线虫生殖能力的影响见图3。

图2　不同酒精度的蓝莓果酒秀丽隐杆线虫生存曲线Fig.2　Survival curves of C.elegans in different alcohol concentrations'blueberry win

图3　不同原花青素浓度的蓝莓果酒秀丽隐杆线虫产卵数的影响Fig.3　Effect of brood size in different PC concentrations' blueberry wine on C.elegans

秀丽隐杆线虫产卵数反映其繁殖能力，研究这个指标能检测出药物对秀丽隐杆繁殖能力的保护作用。由图3可知，与OP50组相比，单一酒精喂食的0 mg/mL（原花青素质量浓度）对照组产卵数极显著减少（P＜0.001），在喂食含原花青素蓝莓果酒后产卵数水平才慢慢恢复，至喂食原花青素质量浓度为2 mg/mL的蓝莓果酒，该试验组产卵数与OP50组近似（P＞0.05）。SPSS分析表明，喂食原花青素质量浓度为2、3、4 mg/mL的秀丽隐杆线虫组间差异并不明显（P＞0.05），当喂食原花青素增至5 mg/mL时，产卵数相对于OP50组有极显著增加（P＜0.001）。

酒精对秀丽隐杆线虫生殖能力的影响见图4。

图4　不同酒精度的蓝莓果酒秀丽隐杆线虫产卵数的影响Fig.4　Effect of brood size in different alcoholic concentrations' blueberry wine on C.elegans

由图4可知，喂食原花青素浓度为3 mg/mL，不同酒精度蓝莓果酒的产卵数变化情况，单一原花青素喂食秀丽隐杆线虫产卵数相对于OP50组有所下降，表明了不含酒精的蓝莓果酒中仍有抑制秀丽隐杆线虫产卵的物质存在，经加入酒精后，蓝莓果酒组间的产卵数也有较大的浮动，且无线性关系，其原因有待后续研究。

2.2不同成分蓝莓果酒对秀丽隐杆线虫运动能力的影响

原花青素对秀丽隐杆线虫头部摆动频率的影响见图5。

图5　不同原花青素质量浓度的蓝莓果酒秀丽隐杆线虫的头部摆动频率的影响Fig.5　Effect of head thrashes in different PC concentrations' blueberry wine on C.elegans

原花青素对秀丽隐杆线虫身体弯曲频率的影响见图6。

图6　不同原花青素质量浓度的蓝莓果酒秀丽隐杆线虫的身体弯曲频率的影响Fig.6　Effect of body bends in different PC concentrations' blueberry wine on C.elegans

运动指标常用来反映神经系统基本功能的指标，观测这个指标可以更直接的检测出药物对秀丽隐杆线虫的抗氧化保护能力。综合图5和图6可知，0 mg/mL组秀丽隐杆线虫头部摆动频率和身体弯曲频率均显著低于OP50组（P＜0.05）。与0 mg/mL对照组相比，喂食不同原花青素质量浓度蓝莓果酒的后，无论高质量浓度还是低质量浓度秀丽隐杆线虫头部摆动频率和身体弯曲频率均明显上升（P＜0.05）。在原花青素浓度为1 mg/mL～4 mg/mL范围内，随着原花青素浓度升高，秀丽隐杆线虫的头部摆动频率和身体弯曲频率也随着增大。但是，5 mg/mL组秀丽隐杆线虫头部摆动频率显著低于4 mg/mL组（P＜0.05），秀丽隐杆线虫身体弯曲频率也没有明显变化（P＞0.05）。上述结果说明，蓝莓果酒中的原花青素对秀丽隐杆线虫的运动行为有较好的促进作用；在一定质量浓度范围内，此促进作用与浓度呈现正相关。

酒精对秀丽隐杆线虫头部摆动频率的影响见图7。

图7　不同酒精度的蓝莓果酒秀丽隐杆线虫的头部摆动频率的影响Fig.7　Effect of head thrashes in different alcohol concentrations' blueberry wine on C.elegans

酒精对秀丽隐杆线虫身体弯曲频率的影响见图8。

图8　不同酒精度的蓝莓果酒秀丽隐杆线虫的身体弯曲频率的影响Fig.8　Effect of body bends in different alcohol concentrations' blueberry wine on C.elegans

综合图7和图8可知，在原花青素质量浓度为3 mg/mL的条件下，不同酒精度蓝莓果酒对秀丽隐杆线虫头部摆动频率和身体弯曲频率的影响。与未加入酒精的蓝莓果酒组（0%组）相比，加入酒精后的蓝莓果酒组的秀丽隐杆线虫产卵数试验头部摆动频率和身体弯曲频率的影响呈现一定的规律性，随着酒精度的升高，头部摆动频率和身体弯曲频率呈梯度显著下降（P＜0.05）；其中20%组相比15%组，降幅较为显著（P＜0.05）。在酒精度达到20%后，在观察中发现秀丽隐杆线虫生长中爬行速度减缓。上述结果表明，蓝莓果酒中的酒精会使秀丽隐杆线虫的运动有所迟滞，可以推测酒精对秀丽隐杆线虫的神经系统有一定的损伤作用，这种作用也与酒精浓度呈正相关。

3　结论

寿命的延长或许与生殖能力存在固有的逆向关系［17］，因此本研究测定线虫产卵数，以了解蓝莓果酒对秀丽线虫在繁殖能力方面所形成的延寿作用。头部摆动频率和身体弯曲频率是线虫运动能力强弱的直观表现，反映神经系统基本功能的指标，也可以间接反映出线虫寿命及生存状态，因此选用其为观察指标，观察难度小、试验周期短，试验成本也比较低［18］。本研究发现，在延缓线虫寿命方面，蓝莓果酒中的原花青素有着重要的作用，是生物活性成分之一；与之相反，蓝莓果酒中的酒精成分会加速线虫的死亡。本研究通过两个单因素（原花青素、酒精）试验，分别使用不同剂量的蓝莓果酒干预秀丽线虫的衰老。结果表明，在寿命方面，原花青素单因素试验中，随着浓度上升，线虫的平均寿命均显著延长，其作用有一定的浓度上限；酒精单因素试验发现，在蓝莓果酒延缓线虫寿命的过程中，酒精产生了负作用。在生殖方面，蓝莓果酒中的酒精成分对线虫产卵能力有明显的抑制作用，原花青素起到了克服酒精抑制作用，随着原花青素浓度的提高，线虫生殖能力逐渐恢复至正常水平，并且出现了产卵高峰期。在运动能力方面，中低酒精度的蓝莓果酒喂养的线虫。头部摆动和身体弯曲有瞬时性增强的现象，但整时段次数明显低于对照组；原花青素对线虫的运动能力起到了较好的保护作用，但原花青素浓度为5 mg/mL的蓝莓果酒，相比4 mg/mL组，保护能力下降，这可能是高浓度对线虫产生了一定的毒性作用，线虫可通过降低运动频率来减少对有毒物质的吸收，从而保障自身的生存状态。

按照本研究的结果可以推断，原花青素是蓝莓果酒中的延缓线虫寿命活性成分之一，但并不是唯一的物质；蓝莓果酒中的酒精反而会缓慢损伤线虫的部分功能，使线虫衰亡，从而缩短线虫寿命。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.004

基金项目：2014年国家级大学生创新创业训练计划项目（201410537002）；2014年湖南省级大学生研究性学习和创新实验计划项目（SCX1407）

作者简介：曾敏（1992—），男（汉），本科在读，食品科学与工程专业，发酵方向。

*通信作者：王远亮（1977—），男（汉），教授，硕士生导师，博士，主要从事微生物技术研究。

收稿日期：2015-04-29

The Effect of Blueberry Wine on Lifespan of C.elegans

ZENG Min，WEI Tao，LI Ke，WANG Chuan-hua，CHEN Chou-wei，WANG Yuan-liang*

（College of Food Science and Technology，，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

Abstract：Explored the substance of blueberry wine on delaying lifespan of C.elegans.The lifespan assay was carried out on model organism C.elegans.Base on blueberry wine，compounded six feeding group（0，1，2，3，4，5 mg/mL）by add different quality of PC，and establish seven feeding group（0%，5%，10%，15%，20%，25%，30%）by add different volume alcohol.Tested the lifespan，reproductive capacity and movement capacity on C.elegans.Feeding the alcohol content of 14%，compared with control group，the lifespan of C.elegans prolonged with promotion of PC concentration of blueberry wine，lifespan of C.elegans longer after 3mg/mL（P＜0.05）；it had different degrees of enhancement effect to the reproductive ability and movement ability（P＜0.05），while the increasing trend in not obvious when PC≥5mg/mL.Shorten the lifespan of C.elegans，accelerate the C.elegans death after feeding the 3 mg/mL of PC，different alcohol content of blueberry wine，its effect was positively related with alcohol content.The reproductive ability and movement ability weakened when alcohol is the single factor test.PC of blueberry wine have the function of the delay lifespan of C.elegans，concentration in the 3 mg/mL to 5 mg/mL obviously；alcohol of blueberry wine increased accumulation will accelerate the death of C. elegans.

Key words：C.elegans；blueberry wine；proanthocyanidin；alcohol；aging随着社会的快速发展，酒精饮料类产品也日益丰富，酒精是酒中不可或缺的组成成分。有研究发现，酒精对小鼠的精子数量和质量有比较明显的毒性作用［1］。长期暴露于低浓度酒精中，对秀丽隐杆线虫的生殖能力有一定的损伤［2］，蓝莓为基质发酵制作的蓝莓果酒作为酒精载体研究果酒对模式生物行为的综合影响的报道并不多。