植物果蔬发酵液对S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用研究

吴彬彬，刘春花，陈宏运，颜晓庆，晏斌，杨莉丽，梁岩，3，*

（1.中国科学院深圳先进技术研究院食品安全与环境技术研究室，广东深圳518055；2.北京大学深圳医院消化内科，广东深圳518036；3.中国科学院新疆生态与地理研究所，新疆乌鲁木齐830011）



植物果蔬发酵液对S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用研究

吴彬彬1，刘春花1，陈宏运1，颜晓庆1，晏斌1，杨莉丽2，梁岩1，3，*

（1.中国科学院深圳先进技术研究院食品安全与环境技术研究室，广东深圳518055；2.北京大学深圳医院消化内科，广东深圳518036；3.中国科学院新疆生态与地理研究所，新疆乌鲁木齐830011）

摘要：研究植物果蔬发酵液对S180荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用，探讨植物果蔬发酵液抑制肿瘤的作用机制。采用S180细胞接种KM小鼠构建荷瘤模型，并灌胃植物果蔬发酵液。通过试剂盒进行甘油三酯、胆固醇以及抗氧化活性等的测定。采用MTT法测定脾细胞增值率，LDH法测定NK细胞活性。低中高剂量植物果蔬发酵液对肿瘤的抑制率分别为18.2%、25.5%和52.7%。不同剂量的发酵液对NK细胞活性、血清总胆固醇和体重无显著影响，但具有提高T细胞活性的趋势。此外，高剂量的植物果蔬发酵液能显著降低甘油三酯水平和肝脏指数（P＜0.05），抗氧化试验结果表明低、高剂量发酵液能增强T-SOD活性。植物果蔬发酵液可能通过改善机体免疫和抗氧化能力发挥抗肿瘤作用，具体机制还需要深入研究。

关键词：植物果蔬发酵液；免疫；抗氧化；抗肿瘤

癌症是人类健康的杀手，一直严重威胁着人们的健康。据2014年世界卫生组织统计，仅2012年全球新增癌症患者1 400多万，而中国新增307万，占全球总量的21.9%［1］。癌症的发生与发展与多种因素有关。近年来，科学研究表明水果、蔬菜及其发酵液能够降低癌症的患病率［2-4］。植物果蔬类发酵液一般是由几十种水果及蔬菜经益生菌发酵而来，含有丰富的营养物质，如维生素、矿物质和多糖［5］。本研究从体内实验入手，研究植物果蔬发酵液（plant fermentation extract，PFE）的抑癌作用并探讨可能的作用机制，为果蔬发酵类健康保健食品的开发和慢性疾病的治疗提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞与动物

S180细胞：由香港科技大学提供；YAC-1细胞：购于普诺赛生命科技有限公司；SPF级KM小鼠：购于广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2013-0002。

1.1.2试剂与耗材

PFE（古元真酵素）：由中科台富科技有限公司提供；脂多糖（LPS）、刀豆蛋白A（ConA）：购于美国Sigma公司；环磷酰胺（Cyclophosphamide，CY）：购于深圳化试科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）：购于广州市唯民生物科技有限公司，T-SOD、CAT、MDA和AOC等试剂盒：购于南京建成生物工程研究所。

1.1.3仪器与设备

CKX41倒置光学显微镜：购于Olympus公司；Thermo 371CO2培养箱、MULTISKAN GO酶标仪：购于Thermo公司；AR224CN电子天平：购于奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1接种

将正常培养的S180细胞接种到KM小鼠腹腔传代3次以上，无菌取出，制成细胞悬液，除空白对照组（blank control group，BCG）外，其余小鼠4×105个/只接种于右侧腋下，24 h后随机分为模型组（model group，MG）、环磷酰胺组（cyclophosphamide treatment group，CYG）、低剂量组（low dose group，LDG）、中剂量组（middle dose group，MDG）和高剂量组（high dose group，HDG）。CYG腹腔注射CY（20 mg/kg/day），LDG灌胃PFE 7.5 mL/kg/day，MDG灌胃PFE 15 mL/kg/day，HDG灌胃PFE 30 mL/kg/day。

1.2.2指标测定

1）瘤种：末次灌胃结束，对小鼠进行禁食处理，眼球取血后脱臼处死，剥离小鼠肿瘤并进行称重。抑瘤率/%=（对照组平均瘤重-剂量组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100。

2）器官指数：处死小鼠后，无菌取脾脏、胸腺及肝脏，分别称重，并计算器官指数，脾或胸腺指数=脾重或胸腺重（mg）/体重（g）。

3）NK细胞活性测定：无菌获取的脾脏，制成单个细胞悬液。台酚蓝染色计数后，RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。取脾细胞和效应细胞（YAC-1细胞）各100 μL，加入U型96孔培养板中，分别设置对照组，实验组和靶细胞最大释放组，于37℃、5%CO2培养箱中培养4 h，然后将96孔培养板以1 500 r/min离心5 min，每孔吸取上清100 μL置96孔平底培养板中，同时加入LDH基质液100 μL，反应3 min，每孔加入1 mol/L的HCl 30 μL，在酶标仪490 nm波长处测定OD值，计算NK细胞活性。

4）ConA、LPS诱导脾淋巴细胞实验：根据Liu等［6］的方法并做修改，调整脾细胞浓度为2×106个/mL，分3孔加入24孔培养板中，分别为对照组，ConA组（2.5 μg/mL）和LPS组（10 μg/mL），置5%CO2、37℃CO2培养箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5 mg/mL）50 μL/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，混匀。然后分装到96孔培养板中，测定570 nm波长吸光值，计算增值率，增值率/%=（OD处理组-OD实验组）/OD对照组×100。

5）抗氧化能力及血脂等实验：严格按照试剂盒说明书操作测定血清T-SOD（总过氧化氢歧化酶）、MDA（丙二醛）和CAT（过氧化氢酶）以及甘油三酯、总胆固醇等含量。

1.3统计方法

使用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），数据为Mean±SE，组间比较采用LSD法，P＜0.05为具有显著差异。

2　结果与讨论

2.1PFE对S180荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用

PFE对S180荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用见图1。

PFE对S180荷瘤肿瘤生长具有抑制作用，可明显减轻肿瘤的重量。随着剂量的增加，瘤重逐渐减轻。低中高PFE组的肿瘤抑制率分别为18.2%、25.5%和52.7%。与模型组相比，高剂量PFE能显著抑制S180荷瘤的生长（P＜0.05）。

2.2PFE对S180荷瘤小鼠体重及血脂等的影响

PFE对S180荷瘤小鼠体重及血脂等的影响见表1。

图1　PFE对S180荷瘤小鼠的肿瘤重量及肿瘤抑制作用Fig.1　Effect of PFE on tumor weight and tumor inhibition ratio of tumor-bearing mice（x±s）

表1　PFE对S180荷瘤小鼠体重、甘油三酯及总胆固醇的影响Table 1　Effect of PFE on body weight，triglyceride and total cholesterol of tumor-bearing mice

表2　PFE对S180荷瘤小鼠胸腺指数，脾脏指数及肝脏指数的影响Table 2　Effect of PFE on thymus index，spleen index and liver index of tumor-bearing mice

表3　PFE对脾脏NK细胞活性及淋巴细胞增殖的影响Table 3　Effect of PFE for NK cell activity and lymphocytes proliferation

从表1可以看出，与模型组相比，不同剂量PFE 对S180荷瘤小鼠体重无显著影响，对血清总胆固醇也无显著影响，但高剂量PFE能显著降低血清甘油三酯浓度（P＜0.05）。

2.3PFE对S180荷瘤小鼠免疫器官及细胞的影响

PFE对S180荷瘤小鼠免疫器官及细胞的影响见表2、表3。

从表2可以看出，与模型组相比，除高PFE组的肝脏指数显著降低外，其他各PFE组小鼠的胸腺指数、脾脏指数和肝脏指数均无显著变化。NK细胞活性实验和LPS刺激脾细胞实验结果表明，不同浓度PFE均对小鼠NK细胞活性和脾脏B细胞活性无显著影响，但Con A刺激实验表明PFE对脾脏T细胞活性虽无显著增强作用（P＞0.05），但具有提高T细胞活性的趋势。

2.4PFE对S180荷瘤小鼠抗氧化能力的影响

PFE对S180荷瘤小鼠抗氧化能力的影响见表4。

表4　PFE对S180荷瘤小鼠CAT，MDA和T-SOD活性的影响Table 4　Effect of PFE on CAT，MDA and T-SOD of tumorbearing mice

CAT检测结果表明各剂量的PFE均轻微降低血清CAT活性（P＞0.05），提示PFE具有较弱清除羟自由基的能力。同时，与模型组相比，中高剂量PFE也能够降低血清MDA含量，说明中高剂量PFE可能在防止脂质过氧化方面具有积极作用。T-SOD测定结果表明PFE能够增强荷瘤小鼠T-SOD酶活力。

3　结论与讨论

PFE是由水果蔬菜等经发酵、过滤而来的液体，与果蔬相比，具有营养均衡、易储存等特点。多项研究表明PFE及其提取物具有良好的抗癌作用［7-9］。李香云等［10］通过测定PFE及大鼠血清中的微量元素含量，初步揭示了PFE的抗癌功效，卢明等［11］研究发现PFE可能通过诱导细胞凋亡、提高机体免疫力发挥抑癌作用，Satoru等［12］发现石榴发酵物也具有一定的癌症预防作用，王智鼎等［13］则通过检测小鼠的免疫系统，确定果蔬发酵饮品能够改善小鼠机体的免疫力。由于果蔬发酵含有丰富的物质，如维生素、多糖、多酚和黄酮等，因此，其可能通过多方面的作用抑制肿瘤的生长，发挥抑癌作用。

本研究从小鼠常规指标、免疫力和抗氧化等多方面研究了PFE对癌症的抑制作用，发现PFE能够降低机体甘油三脂的水平，这与水果能降低甘油三酯的研究相一致［14-15］。本研究还发现PFE在改善机体抗氧化能力方面具有一定的积极作用。MDA的含量可以衡量脂质过氧化程度，间接反映出细胞受损伤程度，而SOD是能够直接清除自由基的酶，其活性直接反映机体的抗氧化水平，因此通过测定机体内SOD和MDA的含量能够反映机体的抗氧化水平。PFE具有降低MDA含量、增强T-SOD活性的趋势，表明其可能通过增强机体抗氧化能力发挥抑癌作用。此外，细胞实验结果表明PFE具有改善T淋巴细胞活性的趋势，这与王智鼎等的研究结果具有一定的相似性。总之，PFE可能通过提高机体抗氧化能力和改善机体免疫能力等多种方式综合发挥抗癌作用，但其具体机制还需要进一步深入研究。

参考文献：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.011

作者简介：吴彬彬（1988—），男（汉），研究助理，硕士，研究方向：生物化学与分子生物学。

*通信作者：梁岩（1968—），女（汉），研究员，研究方向：环境科学、微生物学。

收稿日期：2015-05-25

Inhibitory Effects of Plant Fermentation Extract on Tumor Growth in S180 Tumor-bearing Mice

WU Bin-bin1，LIU Chun-hua1，CHEN Hong-yun1，YAN Xiao-qing1，YAN Bin1，YANG Li-li2，LIANG Yan1，3，*

（1.Laboratory for Food Safety and Environmental Technology，Shenzhen Institutes of Advanced Technology，Chinese Academy of Sciences，Shenzhen 518055，Guangdong，China；2.Digestive Department of the Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen 518036，Guangdong，China；3.Xinjiang Institute of Ecology and Geography，Chinese Academy of Sciences，Urumchi 830011，Xinjiang，China）

Abstract：Anti-tumor effect of plant fermentation extract（PFE）on S180 tumor-bearing mice was studied and the possible mechanisms were explored.Kunming mice transplanted with S180 cells were treated with a PFE via intragastric administration.Reagent kits of triglyceride and total-cholesterol were employed for concentration detection in the serum.Contents of carnitine acylcarnitine translocase（CAT），malondiadehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）in the serum were examined.The MTT method was used in the spleen lymphocyte transformation experiment and LDH was used to detect the NK cell activity.The inhibition ratios of PFE among the 3 treatment groups were 18.2%，25.5%and 52.7%，respectively.However，the treatments showed no significant differences compared to the control in variables of T cell activity，NK cell activity，total-cholesterol content and body weight.High PFE concentration significantly reduced triglyceride level and spleen index（P＜0.05）.Lastly，both low and high PFE concentrations enhanced the antioxidation capacity of S180-bearing mice. The PFE was demonstrated to possess anti-tumor effects in the present in vivo study.Both improved immune response and antioxidation abilities appeared to be responsible for the effects，while further investigation is needed in the future.

Key words：plant fermentation extract；immunity；antioxidation；anti-tumor