调脂保肝汤对非酒精性脂肪肝模型大鼠肝功能、血脂及血糖代谢影响的实验研究

王振江　杨涛莲　王绪霖

(天津中医药大学2012级博士研究生，天津　300193)



实 验 研 究

调脂保肝汤对非酒精性脂肪肝模型大鼠肝功能、血脂及血糖代谢影响的实验研究

王振江杨涛莲1王绪霖2

(天津中医药大学2012级博士研究生，天津300193)

【摘要】目的观察中药调脂保肝汤对非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型大鼠肝功能、血脂及血糖代谢的影响，探讨其治疗NAFLD的作用机制。方法将44只Wistar大鼠随机分为空白组12只和模型组32只，空白组予普通饲料喂养，模型组予高脂饲料喂养。以随机选取2只大鼠达到预期NAFLD病理组织学时间为准，造模8周。造模成功后，模型组大鼠再随机分为高剂量组、低剂量组及对照组，每组10只。高剂量组予相当于生药0.15 g/mL的调脂保肝汤浓缩中药液灌胃，低剂量组予相当于生药0.075 g/mL的调脂保肝汤浓缩中药液灌胃，对照组予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃。8周后计算4组大鼠的肝指数，观察4组大鼠肝功能指标[谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)]、血脂指标[甘油三酯(TG)及总胆固醇(TC)]及空腹血糖(FPG)水平。结果对照组大鼠肝指数明显高于空白组(P<0.05)，高、低剂量组大鼠较对照组均可降低肝指数(P<0.05)，且高、低剂量组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；对照组大鼠ALT、AST及γ-GT水平均高于空白组(P<0.05)，高、低剂量组大鼠较对照组均可降低ALT及AST水平(P<0.05)，且高、低剂量组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量组大鼠较对照组可降低γ-GT水平(P<0.05)，而低剂量组γ-GT水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；对照组大鼠TC、TG及FPG水平均高于空白组(P<0.05)，高、低剂量组较对照组均可降低TC、TG及FPG水平(P<0.05)，高剂量组较低剂量组降低效果更明显(P<0.05)。结论调脂保肝汤对NAFLD疗效确切，其作用机制可能与减少肝细胞脂肪沉积、改善肝功能及纠正血糖、血脂代谢紊乱有关。

【关键词】脂肪肝；中药疗法；调脂保肝汤；血清学；病理学

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种遗传-环境-代谢应激性肝脏损伤综合征，以肝实质细胞脂肪变性与脂肪贮积为病理学特征，且无过量饮酒史(折合酒精量每周男性<140 g，女性<70 g)[1]。NAFLD发病机制尚不十分明确，现代医学缺乏对本病特异有效的治疗药物，但中药具有多靶点、多层次、多途径、整体性调节的特点，逐渐受到临床的重视[2]。本实验拟通过研究调脂保肝汤对NAFLD模型大鼠肝功能、血脂及血糖代谢的影响，探讨其治疗NAFLD的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物Wistar大鼠44只，雄性，体质量(188±10) g，无特定病原体(SPF)级，由天津中医药大学第一附属医院实验动物中心提供(动物合格证号：0014091)，饲养于室温18～24 ℃、明暗各12 h的清洁级动物实验室。

1.2实验药物调脂保肝汤药物组成：金钱草30 g，生牡蛎20 g，夏枯草15 g，虎杖15 g，海藻15 g，决明子20 g，何首乌20 g，丹参20 g。由天津医科大学总医院中药药剂科提供。中药加水约为药物质量的8倍左右，在水中浸泡1 h，每次煎煮 30 min，煎煮3次，煎煮中用冷凝管收集蒸汽中挥发性的药物成分，煎煮完毕后，将3次药液混合，过滤去除药渣，药液浓缩(分别浓缩为相当于生药0.15、0.075 g/mL药液)、灭菌，密封4 ℃冰箱保存，药液有效期为1周，灌药时间为8周，每周制取1次。

1.3主要试剂及仪器胆固醇，纳瑞增(天津)生物科技有限公司；日立7600型全自动生化分析仪，日本日立公司；湘仪TDZ5-WS型低速离心机，湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；AL104UCT型电子分析天平，梅特勒-托利多国际股份有限公司；超薄冰冻切片机，德国Leica公司； B60-32FB3-F01型显微镜，日本OLYMPUS公司。

1.4实验方法

1.4.1分组与造模大鼠适应环境喂养7 d后，利用EXCEL软件随机数法将大鼠随机分为空白组12只和模型组32只。空白组予自由饮水和进食普通饲料；模型组予自由饮水和进食高脂饲料(84%基础饲料，4%蛋黄粉，10%猪油，2%胆固醇)，每周称体质量1次，以最后随机选取2只大鼠达到预期NAFLD病理组织学标准[3]时间为准，预计造模8周。

1.4.2给药造模8周后，在模型组笼中随机选择2只大鼠，肝组织做病理组织学观察，达到中、重度NAFLD的诊断标准[3]，造模成功。模型组利用EXCEL软件随机数法分为高剂量组10只，低剂量组10只，对照组10只。高剂量组予相当于生药0.15 g/mL的调脂保肝汤浓缩中药液灌胃(剂量相当于成人用量的20倍)，低剂量组予相当于生药0.075 g/mL的调脂保肝汤浓缩中药液灌胃(剂量相当于成人用量的10倍)，对照组予0.9%氯化钠注射液灌胃，均按1 mL/100 g灌胃，每日早晨灌胃1次，持续8周。

1.4.3标本采集灌胃8周后，隔夜禁食，先称体质量，以10%水合氯醛0.33 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，解剖大鼠，采用釆血真空管取腹主动脉血样6～10 mL，于4 ℃下静置2 h后，3 000 r/min离心15 min，分离血清，分别装在标记号码的EP管。用无菌镊子和剪刀将大鼠整个肝脏完整分离，电子天平称取肝湿质量，取新鲜肝脏最大叶小块肝组织，立刻浸泡于10%中性甲醛固定液中固定，制作成石蜡切片，整个过程在冰盘上操作。

1.5指标检测观察4组大鼠腹腔内大体标本情况，计算大鼠的肝指数[(肝湿质量/大鼠质量)×100%)]，采用全自动生化分析仪对4组大鼠血清进行肝功能指标[谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)]、血脂指标[甘油三酯(TG)及总胆固醇(TC)]及空腹血糖(FPG)水平检测。固定好的肝组织交由天津中医药大学第一附属医院病理科进行肝脏组织病理学分析。

2结果

2.1脱落情况灌胃第1周由于操作手法不熟练，高剂量组和低剂量组各有1只大鼠因药液呛肺死亡，其余顺利完成实验。

2.2大体标本观察剖开大鼠腹腔，肉眼可见，空白组大鼠腹腔脂肪组织少见，肝脏大小正常，呈暗红色，肝脏包膜无紧张感，切面无油腻感；对照组大鼠腹腔肥大，脂肪组织丰富，肝脏体积明显增大，色泽呈黄色或泛白色，肝脏包膜紧张，切面油腻，呈典型脂肪肝外观；高剂量组及低剂量组较对照组腹腔脂肪组织有不同程度减少，肝脏体积减小，色泽呈暗红色或偏黄色，一部分大鼠肝脏切面有油腻感，高剂量组肝脏外观与空白组比较接近。

2.34组大鼠肝脏组织病理学观察空白组(见封3，图1、2)：肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞及肝血窦沿中央静脉呈放射状整齐排列；肝细胞呈多角形，细胞大小一致，核圆形，位于细胞中央，染色质较稀疏，核膜清楚，偶见肝细胞增生；汇管区无扩大，未见纤维组织增生及炎细胞浸润。对照组(见封3，图3、4)：肝组织结构不清晰，肝小叶结构尚存；肝细胞弥漫水样变性，部分气球样变；肝实质内可见肝细胞多灶状坏死，重度弥漫性脂肪变性(占肝细胞50%～75%)，并见肝细胞再生及增生；部分肝界板破坏，可见碎屑样坏死；汇管区扩大，纤维组织增生，长入肝小叶内，并见纤维间隔形成，伴中等慢性炎细胞浸润。高剂量组(见封3，图5、6)：肝组织结构尚清晰，肝小叶结构存在；肝细胞轻、中度水样变性；肝实质内偶见肝细胞点灶状坏死，肝细胞散在轻、中度脂肪变性(占肝细胞5%～30%)，并见肝细胞再生；局灶性肝界板可见轻度碎屑样坏死；部分汇管区轻度扩大，纤维组织轻度增生，偶见少量慢性炎细胞浸润。低剂量组(见封3，图7、8)：肝组织结构欠清晰，肝小叶结构尚存；肝细胞中度水样变性，小灶性气球样变性；肝实质内可见肝细胞点灶状坏死，肝细胞中度脂肪变性(占肝细胞30%～50%)，并见肝细胞再生及增生；局灶性肝界板可见碎屑样坏死；汇管区扩大，纤维组织增生，长入肝小叶内，部分伴少量慢性炎细胞浸润。

2.44组大鼠肝指数比较见表1。

表1　4组大鼠肝指数比较　±s

与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，△P<0.05

由表1可见，对照组肝指数与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)，对照组高于空白组；高、低剂量组肝指数与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，均低于对照组，且高、低剂量组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.54组大鼠ALT、AST及γ-GT水平比较见表2。

组 别nALTASTγ-GT高剂量组949.41±11.17△150.29±23.44△0.72±0.42△低剂量组960.41±10.89△170.39±28.02△0.90±0.47对照组1088.23±20.90*225.49±38.36*1.20±0.40*空白组1247.93±15.76149.08±31.140.75±0.45

与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，△P<0.05

由表2可见，对照组ALT、AST及γ-GT水平与空白组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，对照组均高于空白组；高、低剂量组ALT及AST水平与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，均低于对照组，且高、低剂量组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量组γ-GT水平与对照组比较差异有统计学意义(P>0.05)，而低剂量组γ-GT水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.64组大鼠TC、TG及FPG水平比较见表3。

由表3可见，对照组TC、TG及FPG与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)，对照组高于空白组；高、低剂量组TC、TG及FPG与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，均低于对照组，且高、低剂量组组间比较差异也有统计学意义(P<0.05)，高剂量组均低于低剂量组。

组 别nTCTGFPG高剂量组91.51±0.14△#0.40±0.13△#13.02±1.83△#低剂量组91.69±0.12△0.57±0.13△14.75±0.97△对照组101.87±0.22*0.74±0.17*16.80±1.86*空白组121.50±0.150.40±0.1712.20±2.07

与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，△P<0.05；与低剂量组比较，#P<0.05

3讨论

近年来，随着人们饮食结构和生活方式的改变，NAFLD发病率呈逐渐增加且有低龄化趋势，我国上海、广州等经济发达地区发病率在15%左右，NAFLD已成为21世纪全球公共健康问题之一[4]。现代医学对本病具体机制尚不十分明确，基本都处于假说阶段，1998年Day发表的“二次打击”学说目前占主要地位[5]。NAFLD患者通常无明显临床症状，部分可有乏力、消化不良、肝区隐痛、肝脾大等非特异性症状及体征，实验室检测则可见肝功能异常、血脂及血糖水平升高等[6]。NAFLD的现代临床上常应用胰岛素增敏剂、抗氧化剂、肝解毒剂、调节脂质代谢、保肝降酶等治疗药物[2]，但治疗方法缺乏特异性，疗效不尽令人满意，不良反应较多，停药易复发。

根据NAFLD临床表现，其应归属于中医学肝癖、胁痛、积聚等范畴，主要病因多为饮食不节、劳逸失度、情志失调、久病体虚、禀赋不足等[7]。调脂保肝汤是以国医大师阮士怡教授临证思想为指导的组方，阮教授经过多年临床实践总结，认为本病当属虚实夹杂之证，虚为脾虚、肾虚，实为痰、瘀互结，并提出涤痰散结、化瘀补肾的治疗大法，临床取得较好疗效[8]。调脂保肝汤方中以金钱草、生牡蛎为君，利湿散瘀，软坚散结；夏枯草、海藻、丹参为臣，助君药加强活血化痰、软坚散结功效，又能清泻肝热；决明子、虎杖、何首乌为佐使药，既助祛湿化痰，又可利水通便，使浊邪有出路，同时何首乌养阴血、补肝肾，使清利而不伤阴，活血而不耗血。诸药配伍，共奏祛痰化瘀、清热利湿、软坚散结之功效。全方用药痰瘀同治，使邪毒从二便而解，则气机畅，痰湿化，瘀血祛，腑气通，从而恢复脏腑的正常功能。现代药理学研究表明，丹参能降低血清和肝组织中TC、TG、游离脂肪酸(FFA)及丙二醛(MDA)含量，降低血清ALT、AST活性，增加超氧化物歧化酶(SOD)活性，增加脂质代谢，抗脂质过氧化，抵抗肝细胞脂肪变性[9]；夏枯草对自由基有一定的清除能力，可以防止肝细胞膜脂质过氧化、降低脂质过氧化产物MDA的生成量[10]；决明子能抑制脂质过氧化反应，提高血清以及肝脏组织内SOD抗氧化活性，降低脂质过氧化产物MDA的含量，调节氧化应激反应，保护肝细胞[11]；虎杖可以改善胰岛素抵抗(IR)，增加对胰岛素敏感性，减少脂肪动员，减轻肝细胞氧超载，从而降低血脂，改善肝功能[12]；何首乌醇提取物可提高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)/TC比值，明显降低TC、TG及FFA、游离胆固醇及胆固醇酯的含量，有保护肝脏和抗肝脏纤维化的作用[13]。

本实验研究结果显示，调脂保肝汤可以有效减少NAFLD模型大鼠腹腔内脂肪堆积，降低肝湿质量和肝指数，减少脂肪在肝脏的沉积，改善肝组织病理学改变，减轻肝细胞的脂肪性变。同时，调脂保肝汤可显著改善肝功能，降低NAFLD大鼠血清ALT、AST及γ-GT水平，但疗效没有表现出明显剂量相关性；纠正血脂、血糖代谢紊乱，降低血TC、TG及FPG水平，且具有一定剂量相关性趋势，剂量越高效果越明显。实验结果表明，中药调脂保肝汤对NAFLD具有疗效确切，其作用机制可能与减少肝细胞脂肪沉积、改善肝功能及纠正血糖、血脂代谢紊乱有关。

参考文献

[1]中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会.非酒精性脂肪性肝病的中西医结合诊疗共识意见[J].中国中西医结合杂志，2011，31(2):155-158.

[2]谢晶日，朱韦儒，朱岩.非酒精性脂肪肝的中医治疗进展[J].中医药信息，2011，28(5):110-111.

[3]中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊断标准[J].中华肝脏病杂志，2003，11(2):71.

[4]中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组．中国非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)[J]．中国医学前沿杂志：电子版，2012，4(7)：4-9．

[5]Day CP.Non-alcoholic fatty liver disease: a massive problem[J].Clin Med (Lond)，2011，11(2):176-178.

[6]黄彧，王峰，牛俊奇.43例脂肪肝临床表现的诊断意

义[J].临床肝胆病杂志，2004，20(2):114-115.

[7]中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会.非酒精性脂肪性肝病的中西医结合诊疗共识意见[J].中国中西医结合杂志，2011，31(2):155-158.

[8]王化良，李艳梅.阮士怡教授治疗内科病学术思想研究[J].天津中医，2002，19(3):4-6.

[9]郭建利，张睦清，韩雪，等．丹参不同组分防治大鼠非酒精性脂肪肝模型作用机制的研究[J]．河北中医药学报，2012，27(1)：8-9．

[10]李良.夏枯草药理作用研究[J].中国现代医生，2013，51(4)：120-121.

[11]马路，江梦溪，刘剑刚，等.决明子和山楂组分配伍对兔肝细胞膜高密度脂蛋白受体活性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2009，15(1):24-28.

[12]张霖，陈育尧，孙学刚，等．虎杖苷对非酒精性脂肪肝大鼠保护作用及机制研究[J]．陕西中医，2010，31(6)：756-758．

[13]苏玮，郭群.何首乌的现代药理研究概况[J].中草药，1997，28(2)：119-121.

(本文编辑：石康)

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.02.022

作者简介：王振江(1986—)，男，医师，博士。研究方向：中西医结合消化系统疾病防治研究。

【中图分类号】R285.5；R289.61

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2016)02-0231-05

(收稿日期：2014-04-25)

Experimental study of Tiaozhi-baogan decoction on liver function and metabolism of glucose and lipid in rats with non-alcoholic fatty liver disease

WANGZhenjiang*,YANGTaolian,WANGXulin.

*2012-GradeDoctorCandidateofTianjinTraditionalChineseMedicineUniversity,Tianjin300193

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of Tiaozhi-baogan decoction on liver function and metabolism of glucose and lipid in rats with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and its mechanism of action. Methods 44 Wistar rats were randomly divided into blank group (n=12) and model group (n=32). Rats in blank group were fed with general diet, and rats in model group were fed with high-fat diet for 8 weeks. After successful modeling, rats in model group were randomly divided into high dose , low dose and control group, 10 rats in each group. High dose group were received concentrate liquid of Chinese herbal medicine(crude drug 0.15 g/mL) by gavage, low dose group were received concentrate liquid of Chinese herbal medicine(crude drug 0.075 g/mL) by gavage and control group were received 0.9% sodium chloride injection by gavage. The liver index was calculated in four groups after 8 weeks. The liver functions including alanine transaminase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and gamma glutamyl transferase (γ-GT), the blood lipid parameters including triglyceride (TG) and total cholesterol (TC), and fasting blood-glucose (FPG) were observed in four groups. Results The liver index in control group was obviously higher than that in blank group (P<0.05). The liver indexes in high and low dose group were decreased as compared with those in control group (P<0.05), and there was no statistical difference between high and low dose group (P>0.05). The levels of ALT, AST and γ-GT in control group were higher than those in blank group (P<0.05), and those in high and low dose group was lower than those in control group (P<0.05), and there was no statistical difference between high and low dose group (P>0.05). The level of γ-GT in high dose group was lower than that in control group (P<0.05), and there was no statistical difference between low dose group and control group (P>0.05). The levels of TC, TG and FPG were higher than those in blank group (P<0.05), and those in high and low dose group were decreased as compared with those in control group (P<0.05), the decrease in high dose group was more obvious than that in low dose group (P<0.05). Conclusion Tiaozhi-baogan decoction has exact effect on NAFLD, its mechanism may be related with the decrease of fat deposition in liver cell, the improvement of liver function, and rectify the derangement in blood glucose and lipid.

【Key words】Fatty liver; Traditional Chinese medicine therapy; Tiaozhi-baogan decoction; Serology; Pathology

1天津中医药大学2013级博士研究生，天津300193

2天津医科大学总医院消化科，天津300052