8味中药对肠道特征菌的调节作用研究

叶清清，王雅茹，方伟彬，刘广锋，冯娟，管淑玉



8味中药对肠道特征菌的调节作用研究

叶清清1，2，3，王雅茹1，2，3，方伟彬1，2，3，刘广锋4，冯娟4，管淑玉1，2，3

（1.广东药科大学 中药学院，广东 广州510006；2.国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室，广东 广州 510006；3.广东高校中药质量工程技术研究中心，广东 广州510006；4.中国水产科学研究院南海水产研究所，广东广州510300）

摘要：目的研究白术、炙甘草、益智、当归、制首乌、白芍、黄连、连翘8味中药对肠道特征菌的调节作用。

方法以嗜酸乳杆菌、粪肠球菌和大肠埃希菌为试验菌株，采用比浊法比较8味中药水提液对以上3株菌株增殖活性的影响，并采用SPSS19.0软件对结果进行聚类分析，探讨上述中药的作用规律。结果 与对照组比较，终质量浓度为0.01 g/mL（以生药计）的白术、炙甘草、益智、当归、制首乌、白芍显著促进嗜酸乳杆菌的增殖（P＜0.05）；炙甘草、益智、制首乌、白芍显著促进粪肠球菌的增殖（P＜0.05），益智、当归显著促进大肠埃希菌的增殖（P＜0.05），白术、炙甘草显著抑制大肠埃希菌的增殖（P＜0.05）；黄连、连翘显著抑制以上3株菌株的增殖（P＜0.05）。聚类分析发现8味中药对肠道特征菌的作用可分为两类：白术、炙甘草、益智、当归、制首乌、白芍为一类，黄连、连翘为一类。结论8味中药对肠道特征菌的增殖活性有不同的影响，白术、炙甘草、益智、当归、制首乌、白芍对肠道特征菌的增殖活性作用相似，均能促进嗜酸乳杆菌的增殖；黄连、连翘对肠道特征菌的增殖活性作用相似，能抑制以上3株试验菌株的增殖。

关键词：中药；肠道菌；菌群失调；增殖活性；规律分析

肠道菌群一般保持着动态平衡，一旦失衡容易引起肠道菌群失调症，引发各种疾病［1-2］。定植于健康人体肠道的正常菌群主要分为有益菌（也称共生菌）和条件致病菌。有益菌紧贴肠道黏膜表面并与黏膜上皮细胞粘连形成生物屏障，发挥营养和免疫调节等作用，它们是肠道优势菌群，主要包括双歧杆菌属和乳杆菌属等。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，L.a）是肠道乳杆菌中的重要成员，其数量多少是衡量肠道菌群正常与否的重要指标之一。

条件致病菌不是优势菌群，但是人体正常菌群的重要组成部分，主要包括肠球菌属和肠杆菌属。粪肠球菌（Enterococcus faecalis，E.f）和大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）是肠道内普遍存在的条件致病菌［3］。近年来的研究发现，中药在治疗肠道菌群失调方面有较好的治疗效果［2］。为此，本文以L.a、E.f和E.coli为肠道菌代表，选用白术、炙甘草、益智、当归、制首乌、白芍、黄连、连翘8种临床常用中药，研究它们对肠道特征菌L.a、E.f、E.coli的调节作用，并分析其作用规律，以期为临床用药提供参考和依据。

1 仪器与材料

1.1 药材

白术Atractylodis Macrocephalae Rhizoma，批号：YPA5F0002；炙甘草 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cumMelle，批号：YPA5D0003；益智Alpinae Oxyphyllae Fructus，批号：YPA4G0001；当归Swertiae Herba，批号：YPA5E0001；制首乌 Polygoni Multiflori Radix Preparata，批号：YPAL0001；白芍Paeoniae Radix Alba，批号：YPA5E000；黄连Coptidis Rhizome，批号：YPA5D0001；连翘Forsythiae Fructus，批号：YPA5A0001，以上药材购于广州采芝林药店，经广东药科大学姬生国教授鉴定符合药典规定。

1.2 菌种与培养基

L.a、E.f由本实验室从益生菌制剂中分离并鉴定；E.coli（菌株号：ATCC25922）由中国水产科学研究院南海水产研究所鉴定保藏。MRS培养基参照文献［4］配制，营养肉汤与营养琼脂培养基参照文献［5］配制。

1.3 仪器与材料

BLx800全自动酶标仪（美国BioTek公司）；SWCJ-1F超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；MJ-78A高压灭菌锅（美国 STIK）；SPX-150B-Z生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

2 方法与结果

2.1 中药对肠道特征菌增殖活性的影响

2.1.1 中药水煎液的制备 分别称取8味药材粗粉各5 g，加水煎煮2次，每次100 mL，合并滤液浓缩并定容至50 mL，得折合生药量为0.1 g/mL的药液。根据文献［6］，使用时稀释至终质量浓度0.01 g/mL（折合生药计）。

2.1.2 菌液的制备 取活化后的L.a和E.f，按1%的接种量分别接种于10 mL MRS液体培养基，37℃培养，L.a培养18 h，E.f培养12 h；E.coli活化后，挑取单菌落于营养琼脂试管斜面37℃培养24 h，用2 mL营养肉汤洗脱，菌液加入装有8 mL营养肉汤的试管中混合。L.a菌液浓度稀释至108CFU/mL，E.f、E.coli菌液稀释至107CFU/mL。

2.1.3 比浊法测定8味中药对肠道特征菌的增殖活性 各试验组按表1加入相应体积的中药药液、液体培养基和菌液混合均匀，L.a 37℃培养48 h，E.f 37℃培养24 h，490 nm下测定各组吸光度（A）；E.coli 37℃培养18 h，630 nm下测定各组A值，其中A给药组=A1-A2，A对照组=A3-A4。采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，给药组和对照组比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。按公式“增殖率=（A给药组/A对照组）×100%”计算增殖率，见图1。

表1 中药活性测定各试验组的组成与体积Table 1 The composition and volume of the test group for the activity of TCMs

与对照组比较：促进作用，*P＜0.05，**P＜0.01；抑制作用，#P＜0.05，##P＜0.01。图1 8味中药对肠道特征菌的增殖活性影响Figure 1 Effect of 8 herbs on the proliferation of representative intestinal bacteria

可见，与对照组比较，终质量浓度为0.01 g/mL（以生药计）的白术、炙甘草、益智、当归、制首乌、白芍可显著促进L.a的增殖（P＜0.05）；炙甘草、益智、制首乌、白芍显著促进E.f的增殖（P＜0.05），益智、当归显著促进E.coli的增殖（P＜0.05），白术、炙甘草显著抑制E.coli的增殖（P＜0.05）；黄连、连翘显著抑制3株菌株增殖（P＜0.05）。

2.2 8味中药对L.a、E.f、E.coli调节作用的规律分析

为判断8味中药之间作用的相似性，找到作用规律，以8味中药对L.a、E.f、E.coli的增殖率为指标，采用SPSS19.0软件进行聚类分析。本研究采用系统聚类法中的组间连接法对样本进行聚类，得到的树状图见图2。

图2　8味中药的聚类分析结果Figure 2 Results of cluster analysis of 8 herbs

可见，8味中药对肠道特征菌的调节作用被聚为两类：第一类有益智、白芍、炙甘草、白术、当归、制首乌，这类中药能显著促进L.a菌株增殖；第二类有黄连、连翘，这类中药对3株试验菌株均有显著抑制作用。

3 讨论

近年来，中药对肠道菌群的调节研究已在国内外广泛开展。成扬等［7］发现健脾活血方可以改善酒精性脂肪肝模型肠道细菌群落的构成。鄢伟伦等［8］发现白术会使小鼠肠道双歧杆菌、乳杆菌增多，肠杆菌减少，肠球菌无变化，进而改善肠道内菌群状况。罗艳春等［9］发现，白术能增加盐酸林可霉素导致的肠道菌群失调大鼠模型肠道双歧杆菌、乳酸杆菌数量，降低肠杆菌数量。本研究经聚类分析发现，归脾经药物益智、白芍、炙甘草、白术、当归和归肝经药物制首乌对肠道特征菌调节作用相似，均能显著促进有益菌的增殖。聚类结果结合文献分析提示，调肝健脾药可能具有通过促进有益菌增殖而改善肠道菌群的作用。

黄连、连翘对肠道特征菌的调节作用相似，均能抑制E.f、E.coli和L.a的增殖。黄连具有清热燥湿、泻火解毒之功，连翘具有清热解毒、疏风散热之功。现代研究证明，黄连、连翘具有抗病原微生物、解热、抗感染等药理作用，其治疗细菌感染性疾病的显著功效已被临床验证［10］。黄连、连翘性味苦寒，抗菌谱广，本研究结果显示黄连、连翘抑制E.f和E.coli生长的同时也会抑制有益菌L.a的生长，故临床使用应在中医指导下用药，以免引起肠道菌群紊乱。

参考文献：

［1］NIU Hui，BAO Weimin，GONG Kunmei，et al.The comparative research on intestinal flora population of patients with colorectal cancerand normal people［J］.J Kunming Med Univ，2009，30（12）：97-100.

［2］刘骏，孙经梦，王辉.肠道菌群与疾病发生及中草药调节和治疗作用的研究概述［J］.中国微生态学杂志，2013，25（7）：855-857.

［3］刘重阳，陈东风.肠道菌群在炎症性肠病发病中的作用［J］.重庆医学，2009，38（10）：1251-1253.

［4］凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法［M］.北京：中国轻工业出版社，1999：146.

［5］李将，刘广锋，李瑶，等.金黄色葡萄球菌生物膜形成规律及清开灵颗粒对其影响研究［J］.广东药学院学报，2015，31（1）：114-116.

［6］刘丽莎，王锐，旭日花，等.白术多糖对益生菌的促生长作用及结构分析［J］.食品科学，2010，31（19）：124-128.

［7］成扬，汪海慧，胡义扬，等.健脾活血方对Lieber-DeCarli酒精性脂肪肝大鼠肠道菌群的影响［J］.中国中西医结合杂志，2011，31（1）：73-79.

［8］鄢伟伦，王帅帅，任霞.白术对小鼠肠道菌群调节作用的实验研究［J］.山东中医杂志，2011，30（6）：417-419.

［9］罗艳春，韩晶莉，罗艳秋，等.黄芪、白术、枳壳对大鼠肠道微生态失调的调整作用［J］.中国老年学杂志，2009，29（6）：1485-1487.

［10］沈映君.中药药理学［M］.上海：上海科学技术出版社，2008：53-57.

（责任编辑：陈翔）

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1006-8783（2016）03-0291-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016012901

收稿日期：2016-01-29

基金项目：国家自然科学基金项目（81001702）；广州市科技计划产学研协同创新重大专项项目（201508020016）；海南省科技兴海专项项目（2015XH03）

作者简介：叶清清（1990—），女，2013级硕士研究生，Email：412911504@qq.com；通信作者：管淑玉（1976—），女，博士，副教授，主要从事中药质量控制与生物活性研究，Email：guanshy3@163.com；冯娟（1974—），女，博士，研究员，主要从事细菌性疾病及免疫防治技术研究，Email：juanf@21cn.com。

Study on the regulation effect of 8 herbs on intestinal diagnostic flora growth

YE Qingqing1，2，3，WANG Yaru1，2，3，FANG Weibin1，2，3，LIU Guangfeng4，FENG Juan4，GUAN Shuyu1，2，3
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmacutical Univercity，Guangzhou 510006，China；2.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM，Guangzhou 510006，China；3.Engineering Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China；4.South China Sea Fisheries Research Institute，China Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China）

AbstractObjective To study the regulation effect on intestinal diagnostic flora of eight herbs including Atractylodis Macrocephalae Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpiniae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus.Methods Lactobacillus acidophilus L.a Enterococcus faecalis E.f and Escherichia coli E.coli used as experimental bacteria the bacterial multiplication was measured by the optical density and SPSS19.0 was used to cluster analysis to explore the role of 8 herbs.Results The multiplication results showed that Atractylodis Macrocephalae Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma

网络出版时间：2016-05-23 16：38 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160523.1638.005.htmlPraeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba could promote the proliferation rate of L.a significantly P＜0.05 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba could promote the multiplication of E.f significantly P＜0.05 Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba could promote the multiplication of E.coli significantly P＜0.05 and Atractylodis Macrocephala Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle could inhibite the multiplication of E.coli significantly P＜0.05 at the final crude herbal concentration of 0.01 g/mL. Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus inhibited the multiplication of L.a E.f and E.coli significantly P＜0.05 at final crude herbal concetration of 0.01 g/mL.Cluster analysis found that Atractylodes Macrocephala Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba were divided a same class while Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus divided another class.Conclusion 8 herbs showed differrent regulation effects on intestinal diagnostic flora.Atractylodis Macrocephalae Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Praeparata cum Melle Alpinae Oxyphyllae Fructus Swertiae Herba Polygoni Multiflori Radix Preparata Paeoniae Radix Alba showed a similar proliferative activity on intestinal flora and promoted the proliferation of L.a.Both of Coptidis Rhizoma and Forsythiae Fructus showed a similar proliferative activity on intestinal flora and inhibited the proliferation of L.a E.f and E.coli.

Key wordstraditional chinese medicine；intestinal bacteria；alteration of intestina；proliferative activity；regularity analysis