产后甲状腺炎患者树突状细胞免疫功能的研究

罗毅平，张艳，张温麑，黄珊，甘艳微，余丹峰（广东省妇幼保健院，广东广州511400）



产后甲状腺炎患者树突状细胞免疫功能的研究

罗毅平，张艳，张温麑，黄珊，甘艳微，余丹峰
（广东省妇幼保健院，广东广州511400）

摘要：目的通过对产后甲状腺炎（PPT）患者外周血树突状细胞（DCs）免疫功能及状态的观察，探讨DCs与PPT发生发展的关系。方法用流式细胞术（FACS）分别检测经培养后来源于PPT患者及正常健康人外周血DCs上CD83、CD80、CD86的表达水平。结果来源于PPT患者外周血DCs上CD83、CD80、CD86分子的表达水平显著高于正常组（P＜0.05），同种混合淋巴细胞反应显示PPT患者组DCs免疫刺激能力显著高于正常组（P＜0.01）。结论DCs免疫功能及成熟分化的增加与PPT的发生密切相关。 关键词：产后甲状腺炎；树突状细胞；免疫功能 中图分类号：R714.14+7

文献标志码：A

文章编号：1006-8783（2016）03-0379-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041701

产后甲状腺炎（PPT）是发生在产后的一种自身免疫性甲状腺疾病，可见于正常分娩或流产妇女。研究提示PPT的发生与宿主的免疫功能变化尤其是T淋巴细胞的分化密切相关［1］。树突状细胞（DCs）是目前发现的功能最强，也是唯一能激活初始型T细胞的抗原提呈细胞，在T细胞的分化过程中具有重要作用。已有研究表明DCs是启动自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、多发性硬化症、自身免疫性脑脊髓炎等疾病参与发病的主要细胞，其通过捕获并提呈抗原，转移至淋巴结，表达共刺激分子、激活T细胞及分泌细胞因子等作用启动免疫应答，参与免疫病态反应［2］。然而目前国内外未见有关于PPT发病中DCs的免疫调节功能的研究。本实验通过观察PPT患者与健康人外周血单核细胞源性DCs的成熟状态及免疫功能的差异，探讨DCs 与PPT发病的相关性。

网络出版时间：2016-05-20 9：51 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160520.0951.001.html

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

Calibur型流式细胞仪（美国BD Bioscience公司）；液闪计数仪（美国PerkinElmer公司）；Ficoll人淋巴细胞分离液（美国 GE Healthcare公司）；RPMI1640培养液（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；重组人白细胞介素4（rhIL-4）、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF）及鼠抗人CD80、CD86、CD83抗原IgG单克隆抗体均购自美国BD pharmingen公司。

1.2 研究对象及标本的选取

采集2012年10月—2015年12月在广东省妇幼保健院内科就诊的50例PPT患者（其中30例甲亢单相型，17例甲减单相型，3例甲亢甲减双相型）外周静脉血作为PPT组，以年龄、孕产次匹配50例健康产后妇女外周静脉血作为正常对照组。两组患者的年龄、孕产次比较，差异无统计学意义，具可比性（见表1）。PPT的诊断标准［3］：①妊娠前无甲状腺疾病病史；②产后6个月内出现TSH异常并FT3、FT4水平异常；③甲状腺TSH受体抗体阴性。排除标准［3］：①产后弥漫性甲状腺肿伴甲状腺功能亢进症；②近期患有急性或慢性感染性疾病；③肝肾功能异常；④近期接受过激素或免疫抑制剂治疗。实验前所有研究对象均签署知情同意书。入选的两组患者分别于产后第90天取20 mL肝素抗凝外周血，以Ficoll淋巴细胞分离液梯度离心富集单个核细胞，RPMI1640液洗涤细胞3次，调整细胞数待用。

表1 正常人及PPT患者一般临床资料情况Table 1 Clinical data of PPT patients and health donors

1.3 DCs的体外培养及富集

人外周血单个核细胞以合适的密度接种于培养瓶内，用含10%（φ）的胎牛血清的RPMI1640培养液，在恒温箱中培养 2 h后遗弃未贴壁细胞，用RPMI1640液轻洗2遍贴壁细胞，再加入4 mL含rhIL-4 500 U/mL和rhGM-CSF 1 000 U/mL细胞因子的完全培养基中培养；每2天全量换液1次，共培养7 d。

1.4 透射电镜观察细胞超微结构

培养7 d后收集足量的DCs，经PBS液洗2次后离心获细胞沉淀，以25%（φ）的戊二醛4℃固定48 h后，再用10 g/L OSO44℃固定1 h，梯度乙醇脱水、包埋，超薄切片经醋酸铀-枸橼酸铅复染后，透射电镜观察并照相。

1.5 流式细胞仪（FACS）检测

培养结束收集细胞，用PBA悬浮为5×106细胞/mL，加入离心管，再加入浓度为5 μg/mL的鼠抗人CD80、CD86、CD83抗原IgG单克隆抗体100 μL，4℃标记30 min，PBA洗细胞1次，沉淀细胞加入FITC-标记兔抗鼠荧光二抗，4℃标记45 min，1%多聚甲醛 500 μL固定细胞，用 FACS检测 CD80、CD83、CD86的表达水平，以荧光吸收度A表示。

1.6 同种混合淋巴细胞反应（MLR）

取健康人外周血20 mL，淋巴细胞分离液密度梯度离心后获取单个核细胞层，用 PBS洗去血小板，37℃贴壁培养1 h，收集悬浮的细胞为同种异体T细胞。调整细胞浓度为1×106细胞/mL。收集培养7 d后的DCs，加入丝裂霉素C 25 μg/mL，37℃，温育45 min。在32孔平底培养板种加入不同人的DCs 200 μL（2×104/孔），再加入健康人T细胞200 μL（2×105/孔），各3孔，在37℃、5%（φ）CO2的环境下培养96 h。于培养结束前16 h加入［3H］标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）2 μCi/孔，多头细胞样品收集仪收集细胞，烘干（80℃，30 min），加入闪烁液5 mL，用液闪计数仪，检测3H-TdR的掺入率（cpm），结果用3孔的均值来表示。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 DCs形态学观察

从外周血中获取单个核细胞，贴壁培养后经rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导，第7天时产生大量DCs，平均从20 mL外周血中可诱导出（1.5～2.0）× 106个DCs，与其他报道相近［4］。培养24 h后大部分细胞贴壁生长，成簇排列，形态未见异常。48 h后，细胞出现不规则形态，同时悬浮细胞增多，以后随着时间的延长，悬浮细胞逐渐增多，异形突起明显。第3～4天时倒置显微镜下可见大部分细胞呈梭形及不规则形状，细胞表面呈毛刺状，第7天细胞生长茂盛，大部分细胞呈不规则形，并且伸出不规则突起，为典型DCs形态，见图1。台盼蓝染色显示，细胞活力在95%以上。

透射电镜下可见DCs成不规则形，细胞表面粗糙，突起明显。细胞核呈肾形和马蹄形，核内异染色质较多，呈团块状，集中分布于核膜处，核浆比增大，胞质中细胞器较少，可见少量线粒体，溶酶体偶见，见图2。

图1　倒置显微镜下培养第7天的DCs形态（400×）Figure 1 Morphology of DCs cultured at 7 days by inverted microscope（400×）

图2　电镜下培养第7天的DCs形态（8 000×）Figure 2 Morphology of DCs cultured at 7 days by electron microscope（8 000×）

2.2 DCs表面CD80、CD86及CD83的表达

FACS分析结果显示，培养7 d后的PPT患者

DCs表面CD80、CD86及CD83表达均显著高于正常组（P＜0.05）。见表2、图3。

表2 正常组及PPT患者DCs表面分子CD80、CD86及CD83的表达率（n=50，%，±s）Table 2 Expression of CD80，CD86 and CD83 in the surface of DCs from PPT patients and health donors

表2 正常组及PPT患者DCs表面分子CD80、CD86及CD83的表达率（n=50，%，±s）Table 2 Expression of CD80，CD86 and CD83 in the surface of DCs from PPT patients and health donors

与正常组比较，*P＜0.05

组别　CD80　CD86　CD83 PPT组　61.41±7.47*　37.28±6.75*　7.18±1.59*正常组　41.76±7.35　29.68±7.32　5.44±1.17

图3　FACS检测培养第7天的DCs表面表型Figure 3 Phenotype characteristics of DCs cultured at 7 days detected by FACS

2.3 同种混合淋巴反应

正常组DCs作为刺激细胞的cpm值为10 000± 2 000，PPT患者组为30 000±3 000。PPT患者组DCs免疫刺激能力显著高于正常组（P＜0.01）。单独加入DCs和T细胞的本底掺入值（cpm）值均小于500。

3 讨论

自日本学者于1977年首次提出产后甲状腺炎的概念以来，许多学者相继对本病进行了调查研究，归纳其临床特征主要为产后1年内出现暂时性甲亢和/或甲低，131I摄取率降低，甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）升高，及甲状腺病理呈淋巴细胞浸润性甲状腺炎改变。PPT是产后妇女的一种常见病。研究报道，PPT在产后妇女中的发病率是 1.1%～21.1%，碘充足地区患病率约7%，孕期及产后血清中TPOAb阳性者，发病率可高达33%～50%［5］。我国学者报告的PPT平均患病率是7.2%［6］。

T淋巴细胞介导的细胞免疫在PPT致病中起重要作用［7］。T细胞的活化需要协同刺激信号的参与，在参与T细胞激活的诸多协同刺激分子中，研究较多的是CD80、CD86共刺激分子，它们均为DCs相关分化抗原。DCs作为一种专职抗原递呈细胞，通过其表面相应配体CD80和CD86与T细胞表面CD28分子相结合，从而启动T细胞介导的免疫反应。在正常情况下，外周血中绝大多数DCs处于非成熟状态，此时 DCs仅表达低水平的共刺激分子（CD80、CD86）和黏附分子，且较少表达CD83这一被认为是DCs充分成熟、有活性的标志物分子［8］。本研究发现，在GM-CSF和IL-4的联合诱导下，PPT患者外周血DCs表面CD80、CD86分子的表达水平显著高于正常人，其刺激T淋巴细胞增殖能力亦显著高于来源于正常人外周血的DCs。另外，与健康人比较，PPT患者外周血经GM-CSF和IL-4联合诱导后，更多地表达反映成熟、有活性DCs标记物CD83，表明获得的是处于成熟状态的DCs。推测原本未成熟的DCs逐渐分化为成熟的DCs，经过迁徙聚集在甲状腺组织上介导免疫反应从而导致PPT的发生。PPT患者可表现为甲亢型、甲减型及甲亢甲减双向型，因样本量关系，本研究未将不同时期及不同甲状腺功能表现PPT患者进行区分，这将是我们今后工作的方向。

综上所述，DCs免疫功能的增强及成熟分化程度的提高与PPT的发生密切相关，这也为免疫抑制治疗PPT提供了理论基础及实验依据。

参考文献：

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［3］谢纹，黎南中，程时武，等.产后甲状腺炎妇女外周血调节性T细胞和辅助性T细胞表达水平分析［J］.临床军医杂志，2015，43（3）：274-276.

［4］MORVA A，LEMOINE S，ACHOUR A，et al.Maruration and function of human dendritic cells are regulated by B lymphocyte［J］.Blood，2012，119（1）：106-114.

［5］BHATTACHARYYA R，MUKHERJEE K，DAS A，et al. Anti-thyroid peroxidase antibody positivity during early pregnancy is associated with pregnancy complications and maternal morbidity in later life［J］.J Nat Sci Biol Med，2015，6（2）：402-405

［6］楼寒钰，吴艺捷.产后甲状腺炎发病机制的研究进展［J］.医学综述，2010，16（9）：1382-1386.

［7］SWELAM E S，BAKR H G，MANSOUR M A.Postpartum thyroid dysfunction：a state of immunological dysregulation ［J］.Clinical Lab，2011，57（9/10）：731-739.

［8］PRYCZYNICZ A，CEPOWICZ D，ZAREBA K，et al. Dysfunctions in the mature dendritic cells are associated with the presence of metastases of colorectal cancer in the surrounding lymph nodes［J］.Gastroenterol Res Pract，2016：2405437.DOI：10.1155/2016/2405437.Epub 2015 Dec 29.

（责任编辑：王昌栋）

收稿日期：2016-04-17

基金项目：广东省医学科研基金立项课题（A2013077）

作者简介：罗毅平（1976—），男，博士，主任医师，主要从事妊娠合并内科疾病及危重症的诊治研究，Email：doctorluoyiping@ 126.com；通信作者：张艳（1979—），女，博士，主治医师，主要从事妊娠合并内科疾病诊治研究，Email：happydragon2012qq@126.com。

Study on the immune function of dendritic cells in postpartum thyroiditis patients

LUO Yiping，ZHANG Yan，ZHANG Wenlan，HUANG Shan，GAN Yanwei，YU Danfeng
（Guangdong Province Maternity and Child Care Hospital，Guangzhou 511400，China）

AbstractObjective To study the immune function of dendritic cells DCs from peripheral blood of postpartum thyroid PPT patients and explore the potential relationship between DCs and the pathogenesis of PPT.Methods Fluorescence activated cell sorter FACS was used to detect the expression of CD83 CD80 and CD86 in the surface of DCs cultured from the peripheral blood of PPT patients or healthy donors.

Results Compared with healthy donors DCs from the peripheral blood of PPT patients expressed higher levels of CD83 CD80 and CD86 P＜0.05 and the capability of T cell proliferation stimulated by DCs from PPT patients was higher either P＜0.01 .Conclusion The increased immune function of DCs may be a reason for the pathogenesis of PPT.

Key wordspostpartum thyroiditis dendritic cells immune function