两种不同的酒精摄入方式诱导的小鼠酒精性肝损伤模型比较

肖 娟，张瑞芬，黄 菲，刘 磊，邓媛元，马永轩，刘 冬，张名位，孙远明1

（1.华南农业大学食品学院，广州 510642；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广州 510610；3.深圳职业技术学院，深圳 518055）



两种不同的酒精摄入方式诱导的小鼠酒精性肝损伤模型比较

肖 娟1，2，张瑞芬2，黄 菲2，刘 磊2，邓媛元2，马永轩2，刘 冬3，张名位2，孙远明1

（1.华南农业大学食品学院，广州 510642；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广州 510610；3.深圳职业技术学院，深圳 518055）

【摘要】目的 筛选一种简便、稳定、可靠的酒精性肝损伤模型。方法 通过酒精灌胃或给予Lierber-DeCarli酒精液体饲料8周来建立酒精性肝损伤小鼠模型。实验期间记录小鼠精神状态、摄食量和体重变化，HE染色进行病理学分析，分析血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）、碱性磷酸酶（AKP）活性，血清和肝脏总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量等肝损伤指标。结果 造模8周后，两种方式均导致小鼠肝脏脂质聚集等组织病理学变化，血清ALT、AST、AKP活性、血清和肝脏TG含量均显著提高，提示出现明显肝损伤。酒精灌胃导致小鼠精神状态差，并显著减轻体重，而酒精液体饲料对小鼠精神状态和体重影响小。酒精液体饲料模型肝脏指数和血清TC水平显著增加，而且血清ALT、AST活性、血清和肝脏TG含量及肝脏脂质聚集等组织病理学变化幅度大于酒精灌胃模型，提示前者的肝损伤程度比后者严重。结论 Lieber-DeCarli酒精液体饲料模型优于酒精灌胃模型。Lieber-DeCarli酒精液体饲料模型相对酒精灌胃模型更适合用于酒精性肝损伤分子机制的研究和防治药物的筛选。

【关键词】酒精性肝损伤；Lierber-DeCarli酒精液体饲料；灌胃；模型，动物；

流行病学研究表明，全球酒精性肝病发病率逐年升高，该病已成为肝脏疾病中仅次于病毒性肝炎的第二大病因［1］，其致死率已经远超过乳腺癌、肠癌和前列腺癌等癌症疾病［2，3］。为此，酒精性肝损伤成为近年来国内外学者研究的焦点之一［4］。目前对酒精性肝损伤的研究主要集中于探讨其致病机理、预防措施以及防治药物的筛选等［5，6］。稳定可靠的酒精性肝损伤动物模型是研究其致病机理和防治措施的基础和必备条件。国内外常用的酒精性肝损伤模型主要有3种，酒精灌胃模型、Lieber-DeCarli酒精液体饲料模型和Tsukamato-French模型［7］。Tsukamato-French模型对实验技术和实验动物的要求严格、费用昂贵，故难以推广使用［8］。酒精灌胃模型、Lieber-DeCarli酒精液体饲料模型均能较好的复制出酒精性脂肪肝，但两种模型的动物精神状态、肝损伤程度等是否有差异尚不清楚［7］。本文主要以小鼠的精神状态、体重和肝损伤程度等为指标来比较酒精灌胃和Lieber-DeCarli酒精液体饲料诱导的酒精性肝损伤小鼠模型的差异，以筛选稳定、可靠的动物模型，为酒精性肝损伤的基础研究，特别是植物活性成分对其改善作用的评价提供稳定可靠的动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠60只，体重18～22 g （8周龄）来源于中山大学（大学城）实验动物中心【SCXK（粤）2011-0029】。动物饲养于中山大学实验动物中心【SYXK（粤）2012-0081】屏障环境动物房（室温22±1℃，相对湿度为55% ～60%，12 h光照/12 h黑暗）。动物组织取材中，按实验动物使用的3Rs原则给予人道的关怀。小鼠适应性喂养1周后，按体质量随机分为正常对照组（normal control）、酒精灌胃组（oral ethanol gavage）、对照液体饲料组（control liquid diet）和酒精液体饲料组（ethanol liquid diet），每组15只。正常对照组和酒精灌胃组小鼠5只/笼，以全价营养颗粒饲料饲养，自由进食及饮水；对照液体饲料和酒精液体饲料组小鼠3只/笼，分别给予对照液体饲料和酒精液体饲料，饲料现配现用，每天记录摄食量，酒精液体饲料组小鼠自由进食，对照液体饲料组小鼠饲料给予量为前1 d酒精液体饲料组的平均摄食量。

1.2 试剂与仪器

Lieber-DeCarli高脂肪型酒精液体饲料（含4% （w/v）酒精；饲料热量组成为蛋白质热量18%、酒精热量28%、其他碳水化合物热量19%、脂肪热量35%）（代码：TP 4030B）及其对照液体饲料（不含酒精；饲料热量组成为蛋白质热量18%、碳水化合物热量47%，脂肪热量35%）（代码：TP 4030BC）购于南通特洛菲饲料科技有限公司。ALT、AST、γ-GT、AKP、TC和TG试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。高速/冷冻离心机（Thermo，美国），-80℃低温冰箱（Thermo，美国），低速离心机（Thermo，美国），酶标仪（Tecan，瑞士），差相荧光倒置显微镜（Leica，德国）。

1.3 实验方法

1.3.1 酒精肝损伤小鼠模型建立：酒精灌胃诱导酒精肝损伤小鼠模型建立：酒精灌胃组的酒精适应期为1周，酒精灌胃剂量由0.5 g/（kg·体重）逐步增加到6 g/（kg·体重）；其造模期为8周，1～4周剂量为6 g/（kg·体重），5～8周剂量为 5 g/（kg·体重）［9-11］。正常对照组灌胃等量的蒸馏水。酒精或蒸馏水灌胃量为0.1 mL/10（g·体重）。

Lieber-DeCarli酒精液体饲料酒精肝损伤小鼠模型建立：酒精液体饲料组先经过液体饲料适应期（3 d）后，再根据小鼠酒精性脂肪肝模型的建立方法（经典法）说明书进行酒精适应期（4 d，第1～4 d酒精液体饲料与对照液体饲料混合的比例分别为1：4、2：3、3：2和4：1），然后进入造模期，以酒精液体饲料喂养造模8周［12-14］。

1.3.2 取材：小鼠禁食12 h后，乙醚麻醉小鼠，摘眼球取血，处死小鼠，肝脏用冰生理盐水漂洗、滤纸吸干水后，切取1 cm3肝脏固定于4%多聚甲醛，用于HE染色；剩余肝脏迅速分装后-80℃冻存。血液4℃放置1～1.5 h后4℃4 000 r/min离心15 min后，取上清液立刻用于指标测定。

1.3.3 指标测定：

1.3.3.1 血清 ALT、AST、γ-GT、AKP活性，TC和TG含量：血清ALT、AST采用赖氏法，γ-GT、AKP采用比色法，TC和TG采用甘油激酶-磷酸甘油氧化酶-过氧化物酶比色法，操作严格按试剂盒说明书进行。

1.3.3.2 肝脏TC和TG含量：取200 mg湿肝脏，加入9倍体积的氯仿-甲醇（2∶1）溶液［15］，制备匀浆，离心后取10 μL上清液检测，采用甘油激酶-磷酸甘油氧化酶-过氧化物酶比色法，按试剂盒说明书进行操作。

1.3.3.3 HE染色观察肝组织病理学形态：按常规方法制作石蜡切片并进行HE染色，光镜下观察肝脏形态变化。

1.4 统计学方法

数据以平均值±标准偏差表示，采用SPSS 16.0软件，进行t检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 精神状态及死亡率

实验过程中正常对照组及对照液体饲料组小鼠精神状态好，食欲佳，皮毛有光泽。酒精灌胃组小鼠酒醉现象严重、应激反应严重、精神萎靡、活动减少、反应迟钝、皮毛无光泽，在造模期第4周死亡3只。酒精液体饲料组小鼠也有酒醉现象，但比酒精灌胃组小鼠要轻微，无应激反应，精神状态和反应均较正常，动物未出现死亡。

2.2 体重

正常对照组小鼠体重持续增长图1（A），酒精灌胃组小鼠体重缓慢增长，从造模期第4周开始，正常对照组小鼠体重显著高于酒精灌胃组小鼠（P＜0.05）。对照液体饲料组和酒精液体饲料组体重缓慢增长后趋于平衡图1（B），在造模期第2周至造模期第6周，对照液体饲料组体重显著高于酒精液体饲料组（P＜0.05），在造模期第7周至造模期第8周，对照液体饲料组小鼠与酒精液体饲料组小鼠体重差异无显著性（P＞0.05）。结果表明，酒精灌胃显著减轻小鼠体重，而酒精液体饲料对小鼠体重影响小。

2.3 摄食量

整个饲养过程中，正常对照组与酒精灌胃组小鼠摄食量差异无显著性（图2）；对照液体饲料组和酒精液体饲料组小鼠摄食量差异无显著性，表明酒精灌胃和酒精液体饲料对小鼠摄食量无显著影响。

2.4 肝脏组织病理学形态变化

从图3中可见，正常对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉向四周呈放射状排列；酒精灌胃组小鼠部分肝细胞出现脂肪变性，大部分脂肪空泡小，少数脂肪空泡大。对照液体饲料组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉向四周呈放射状排列，少量肝细胞出现脂肪变性，脂肪空泡细小；而酒精液体饲料组小鼠大量肝细胞出现脂肪变性，脂肪空泡大，其余的大部分肝细胞变性、肿胀，胞浆内充满小的脂肪空泡，高倍镜下可观察到肝细胞细胞核浓缩和核溶解，以及炎性细胞浸润。与酒精灌胃组相比，酒精液体饲料组小鼠肝脏脂质聚集程度明显增加。

2.5 肝脏指数

与正常对照组相比，酒精灌胃组小鼠肝脏指数差异无显著性（表1）。与对照液体饲料组相比，酒精液体饲料组小鼠肝脏指数显著提高27.62%（P＜0.05）（表2），提示酒精液体饲料组小鼠肝脏出现肿胀、脂质聚集等变化，该结果与肝脏组织病理学形态变化结果相互印证。

2.6 小鼠血清ALT、AST、γ-GT、AKP活性

与正常对照组相比，酒精灌胃组小鼠血清ALT、AST、AKP活性均显著提高（P＜0.05），提高幅度分别为28.09%、110.32%、43.60%（表1），提示肝脏出现损伤。与对照液体饲料组相比，酒精液体饲料组小鼠血清ALT、AST和AKP活力均显著提高（P＜0.05），提高幅度分别为 86.41%、187.75%、34.78%（表2），提示肝脏出现损伤。对比肝功能特征指标血清ALT、AST活性的变化程度，可发现酒精液体饲料组的变化幅度大于酒精灌胃组，提示酒精液体饲料诱导的肝脏损伤可能比酒精灌胃诱导的肝脏损伤更严重。

注：#表示差异有显著性（P＜0.05）。图1 酒精灌胃（A）和Lierber-DeCarli酒精液体饲料（B）诱导的酒精性肝损伤小鼠模型体重变化Note.#：Significantly reduced body weight（P＜0.05）.Fig.1 Changes of body weight of the oral ethanol gavage model（A）and Lierber-DeCarli ethanol liquid diet model（B）

2.7 小鼠血清及肝脏TG和TC含量

与正常对照组相比，酒精灌胃组小鼠血清TG和肝脏TG含量均显著提高（表1）（P＜0.05），提高幅度分别为23.80%和11.40%，但是，两组小鼠的血清TC和肝脏TC含量差异无显著性，提示灌胃酒精诱导的酒精肝损伤模型表现出一定的肝损伤。与对照液体饲料组相比，酒精液体饲料组小鼠血清TG、TC和肝脏TG含量均显著提高（P＜0.05），提高幅度为32.13%、21.90%和14.47%（表2），提示酒精液体饲料能导致一定程度的肝损伤。

酒精液体饲料组小鼠血清 TC显著增加，而酒精灌胃组该指标无显著变化。对比小鼠血清TG和肝脏TG含量变化程度，可发现酒精液体饲料组的变化幅度略大于酒精灌胃组。提示酒精液体饲料诱导的肝脏损伤可能比酒精灌胃诱导的肝脏损伤更严重。该结果与肝脏病理变化相互印证。

图2 酒精灌胃（A）和Lierber-DeCarli酒精液体饲料（B）诱导的酒精性肝损伤小鼠模型摄食量变化Fig.2 Changes of food intake of the oral ethanol gavagemodel（A）and Lierber-DeCarli ethanol liquid diet model（B）

3 讨论

稳定可靠的动物模型是研究ALD的分子机制和防治措施的基础。酒精灌胃和Lieber-DeCarli酒精液体饲料诱导的ALD模型均为国内外公认的ALD模型［7］。酒精灌胃模型操作简便，能够控制酒精摄入量，可维持血中有效酒精浓度，容易复制酒精性脂肪肝和肝炎，但动物易产生应激反应，死亡率高。Lieber-DeCarli酒精液体饲料诱导的ALD模型是使动物能主动饮用酒精液体饲料，可复制出酒精性脂肪肝和肝炎，其优点是试验者能够通过配对喂养主动控制能量摄入，保持各组间的能量平衡，排除营养摄入即摄入能量不均对实验的结果的影响［11，16］。

图3 酒精灌胃和Lierber-DeCarli酒精液体饲料诱导的酒精性肝损伤小鼠模型肝脏组织病理形态变化（HE染色，×200，标尺=100 μm）Fig.3 Histological changes of the liver tissues in the oral ethanol gavage and Lierber-DeCarli ethanol liquid diet mouse models.（HE staining，×200，Bar=100 μm）

表1 酒精灌胃诱导的酒精性肝损伤小鼠模型肝脏指数、血清ALT、AST、γ-GT和AKP活性，血清和肝脏中甘油三酯和总胆固醇水平的变化（-±s）Tab.1 Changes of the liver-to-body weight ratio，serum ALT，AST，γ-GT and AKP activities，serum and hepatic TG and TC contents in the oral ethanol gavage models.

表1 酒精灌胃诱导的酒精性肝损伤小鼠模型肝脏指数、血清ALT、AST、γ-GT和AKP活性，血清和肝脏中甘油三酯和总胆固醇水平的变化（-±s）Tab.1 Changes of the liver-to-body weight ratio，serum ALT，AST，γ-GT and AKP activities，serum and hepatic TG and TC contents in the oral ethanol gavage models.

注*表示在0.05水平上差异有显著性（P＜0.05）。Note.*means a significant difference（P＜0.05）.

变化幅度/% Change/%肝脏指数Liver-to-body weight ratio/%　3.34±0.33　3.59±0.33谷丙转氨酶ALT/U/L　29.39±3.82　37.65±9.66*　+28.09%谷草转氨酶AST/U/L　10.72±2.86　22.55±3.83*　+110.32% γ-谷氨酰转移酶γ-GT/U/L　3.24±0.74　3.68±0.89碱性磷酸酶AKP/U/L　59.79±10.32　85.85±14.51*　+43.60%血清甘油三酯Serum TG/mmol/L　0.94±0.12　1.16±0.21*　+23.80%血清总胆固醇Serum TC/mmol/L　2.58±0.38　2.75±0.46肝甘油三酯Hepatic TG/mg/g liver　11.98±1.26　13.34±1.47*　11.40%肝总胆固醇Hepatic TC/mg/g liver　4.90±0.75　5.58±0.88指标Indexs正常对照组Normal control酒精灌胃组Oral ethanol

本实验利用酒精灌胃和Lieber-DeCarli酒精液体饲料诱导小鼠酒精性肝损伤，造模8周，肝脏出现明显脂质聚集，小鼠血清ALT、AST、AKP活性，血清TG和肝脏TG含量均显著提高，这些都符合早期酒精性肝损伤的变化特点［2，3］，表明酒精灌胃组和酒精液体饲料组小鼠均出现明显酒精性脂肪肝。但是，酒精灌胃组小鼠酒醉现象严重、精神状态差；酒精液体饲料组小鼠也有酒醉现象，但比酒精灌胃组小鼠要轻微，无应激反应，精神状态和反应均较正常，这有可能是因为酒精灌胃所用的酒精浓度高（50%酒精），对小鼠的刺激大，而酒精液体饲料中酒精的浓度仅为4%，对小鼠的刺激很微弱，因此从精神状态上来看酒精液体饲料模型优于酒精灌胃模型。本实验中酒精液体饲料诱导的ALD模型未出现死亡，而酒精灌胃的第4周小鼠死亡3只。研究表明酒精灌胃剂量低无法诱导酒精性脂肪肝形成，而剂量高易导致大量动物死亡［7］。灌胃5 g/ （kg·体重）或6 g/（kg·体重）酒精（酒精浓度40%～52%）8周成功诱导酒精性脂肪肝形成［9，10］，Zeng等［11］研究表明4 g/kg·体重 酒精灌胃8周不能导致小鼠肝损伤（脂肪肝）的发生。因此，本实验中酒精灌胃剂量在1～4周为6 g/（kg·体重），在出现小鼠死亡后，酒精灌胃剂量调整为5 g/（kg·体重）。灌胃酒精显著减轻小鼠体重，由于灌胃酒精对摄食量无显著影响，那么体重的减少很可能是由于高浓度酒精刺激影响胃肠道的消化吸收功能造成的［17，18］；而酒精液体饲料对小鼠体重影响小，很可能是因为进行了配对喂养，使得酒精液体饲料组与其对照组的能量摄入保持一致，这体现了Lieber-DeCarli酒精液体饲料模型的优点。

对照液体饲料组肝脏HE染色结果显示有少量脂质聚集，原因是对照液体饲料是高脂肪型饲料，食用时间较长的情况下小鼠肝脏会有少量脂质聚集，因此造模时间一般不超过8周［7］。Ge et al.［13］和Wang et al.［14］的研究也发现造模8周后，HE染色和油红O染色显示对照液体饲料组小鼠肝脏有轻微脂质聚集。

比较酒精灌胃组和液体酒精饲料相对各自对照组的变化程度发现：（1）液体酒精饲料模型肝脏指数显著增加，血清TC水平显著提高，而酒精灌胃模型这两个指标无显著变化。（2）两个模型的血清ALT、AST活性、血清和肝脏TG含量均显著变化，但液体酒精饲料模型的变化幅度大于酒精灌胃模型。（3）液体酒精饲料模型的肝脏脂质聚集等病理变化比酒精灌胃模型的严重。提示Lieber-DeCarli酒精液体饲料模型优于酒精灌胃模型。

因此，从精神状态、体重和肝损伤程度等方面来看，Lieber-DeCarli酒精液体饲料模型优于酒精灌胃模型。

表2 Lierber-DeCarli酒精液体饲料诱导的酒精性肝损伤小鼠模型肝脏指数、血清ALT、AST、γ-GT和AKP活性，血清和肝脏中甘油三酯和总胆固醇水平的变化（±s）Tab.2 Changes of the liver-to-body weight ratio，serum ALT，AST，γ-GT and AKP activities，serum and hepatic TG and TC contents in the Lierber-DeCarli ethanol liquid diet models

表2 Lierber-DeCarli酒精液体饲料诱导的酒精性肝损伤小鼠模型肝脏指数、血清ALT、AST、γ-GT和AKP活性，血清和肝脏中甘油三酯和总胆固醇水平的变化（±s）Tab.2 Changes of the liver-to-body weight ratio，serum ALT，AST，γ-GT and AKP activities，serum and hepatic TG and TC contents in the Lierber-DeCarli ethanol liquid diet models

注*表示在0.05水平上差异有显著性（P＜0.05）。Note.*means a significant difference（P＜0.05）.

变化幅度/% Change/%肝脏指数Live-to-body weight ratio/%　3.00±0.57　3.82±0.51*　+27.62%谷丙转氨酶ALT/U/L　23.35±7.40　43.54±14.26*　+86.41%谷草转氨酶AST/U/L　10.48±1.20　30.16±5.10*　+187.75% γ-谷氨酰转移酶γ-GT/U/L　3.14±0.68　3.90±0.99碱性磷酸酶AKP/U/L　67.97±12.65　91.61±12.21*　+34.78%血清甘油三酯Serum TG/mmol/L　0.92±0.11　1.22±0.23*　+32.13%血清总胆固醇Serum TC/mmol/L　2.58±0.28　3.14±0.30*　+21.90%肝甘油三酯Hepatic TG/mg/g liver　14.02±1.26　16.05±2.17*　+14.47%肝总胆固醇Hepatic TC/mg/g liver　8.06±1.48　8.46±1.67指标Indexs对照液体饲料组Control liquid diet酒精液体饲料组Ethanol liquid diet

4 结论

Lieber-DeCarli酒精液体饲料诱导的酒精肝损伤小鼠模型精神状态良好，肝脏指数显著增加，血清TC水平显著提高，血清ALT、AST活性、血清和肝脏TG含量及肝脏脂质聚集等组织病理学变化幅度大于酒精灌胃诱导的酒精肝损伤小鼠模型。相对酒精灌胃，Lieber-DeCarli酒精液体饲料对动物精神状态影响小、易于形成酒精脂肪肝，因此更适合用于酒精性肝病分子机制的研究和防治药物的筛选。

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〔修回日期〕2016-03-22

【中图分类号】R-33

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856（2016）06-0011-07

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.06.003

［基金项目］国家自然科学基金-青年科学基金项目（NSFC 31501478）；广东省自然科学基金博士启动项目（2014A030310328）；深圳市科技计划基础研究项目（JCYJ20140901162541286）；广东省省级科技计划项目（2016B070701012）。

［作者简介］肖娟（1985-），女，博士后，研究方向：植物活性物质与功能食品。

［通讯作者］孙远明（1958-），男，教授，博士生导师，研究方向：食品安全检测。injury was assessed by the activities of serum ALT，AST，AKP and γ-GT，and serum and hepatic TC and TG.Results After modeling，both models showed significantly increased activities of serum ALT，AST，AKP，and contents of serum and hepatic TG（P＜0.05），indicating the successful development of alcoholic steatohepatitis.However，oral ethanol gavage led to body weight loss and weak mental state.Ethanol liquid diet less affected the body weight and mental state.Ethanol liquid diet enhanced liver to-body weight ratio and serum TC，but oral gavage of ethanol did not.The changes of serum ALT，AST，serum and hepatic TG，and hepatic steatosis in the ethanol liquid diet models were more severe than those in the oral gavage ethanol models，suggesting that Lierber-DeCarli ethanol liquid diet led to more serious liver injury than oral gavage ethanol.Conclusions Lierber-DeCarli ethanol liquid diet model is better than oral gavage ethanol model，and is more suitable for studies on mechanisms and evaluation of hepato-protective drugs for alcoholic liver disease.

Comparison of two mouse models of alcoholic liver disease induced by oral ethanol gavage or Lierber-DeCarli ethanol liquid diet

XIAO Juan1，2，ZHANG Rui-fen2，HUANG Fei2，LIU Lei2，DENG Yuan-yuan2，MA Yong-xuan2，LIU Dong3，ZHANG Ming-wei2，SUN Yuan-ming1
（1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Sericultural& Agri-Food Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods，Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Guangzhou 510610；3.Shenzhen Polytechnic，Shenzhen 518055）

【Abstract】Objective To select a simple，stable and reliable mouse model of alcoholic liver disease.Methods The mouse models of alcoholic liver disease were induced by oral gavage ethanol or Lierber-DeCarli ethanol liquid diet for 8 weeks.The food intake and body weight were recorded.Pathological changes were examined using HE staining.Liver

【Key words】Alcoholic liver disease；Lierber-DeCarli ethanol liquid diet；Alcohol；Oral gavage；Mouse model