FTA-巢式PCR方法鉴定溶组织内阿米巴原虫的初步研究

卢　艳，陈家旭，张永年，李　浩，储言红，艾　琳，蔡玉春，陈韶红



FTA-巢式PCR方法鉴定溶组织内阿米巴原虫的初步研究

卢艳，陈家旭，张永年，李浩，储言红，艾琳，蔡玉春，陈韶红

中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心，上海200025

摘要：目的建立一种简便、快速的FTA-巢式PCR方法用于鉴定粪便中溶组织内阿米巴原虫(Entamoeba histolytica, E.h)。方法收集门诊腹泻病人新鲜粪便，用光学显微镜进行初步检查。用FTA卡抽提镜检结果为阳性的粪便DNA，根据溶组织内阿米巴原虫的SSU -rRNA序列设计引物，进行巢式PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶分析，并对阳性产物进行测序和序列比对分析。结果根据光学显微镜检测结果，挑选了44例镜检结果为阿米巴原虫阳性的腹泻病人粪便。经FTA-巢式PCR扩增，其中20例样本可扩增出427 bp左右的目的条带，目的条带的测序和序列分析结果表明为溶组织内阿米巴原虫。镜检方法与巢式PCR方法的阳性符合率为45.45%(20/44)，将E.h与形态学相似的其他内阿米巴原虫进行了鉴定和区分。结论本研究建立的FTA-巢式PCR方法具有简单、快速、准确等优点，为临床检验和流行病学调查中E.h的鉴别诊断提供了新的技术方法。

关键词：溶组织内阿米巴；FTA；巢式PCR；鉴定

阿米巴肠病是由于溶组织阿米巴(Entamoebahistolytica,E.h)寄生于结肠内，引起阿米巴痢疾或阿米巴结肠炎一种人兽共患寄生虫病[1]。该病分布范围广，易感机体较多，呈世界性流行传播。全球每年约有5千万人感染，因阿米巴肠炎和阿米巴肝脓肿(amoebic liver abscess, ALA)而死亡的人数高达10万[1-2]，其病死率在原虫寄生虫病感染中仅次于疟疾[3]。E.h原虫在人体内以滋养体和包囊两种形式存在，人感染后既可出现严重的侵袭性症状，也可处于无症状的带虫状态。

检测E.h原虫常用的方法有直接涂片法和碘液染色法。但肠内除了E.h外，还有非致病性的阿米巴——迪斯帕内阿米巴(E.dispar,E.d)，其形态与E.h高度相似，镜检方法难以区分，且E.d的感染率是E.h的9倍[4-6]。随着分子生物学的发展，明确了E.h和E.d核酸序列的差别，通过PCR的方法可以将两者区分开来，为阿米巴原虫的生物鉴定提供了新的途径[7-9]。本研究在形态学鉴定(直接涂片、碘液染色)的基础上，拟建立一种快速、敏感的FTA-巢式PCR检测用于鉴定致病性的E.h。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1腹泻病人粪便样本中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所健康教育咨询检测中心门诊腹泻病人新鲜粪便，一般取有黏液、血液部位进行收集检查。

1.1.2主要试剂0.9% 生理盐水，2.5%碘液，E.h基因组DNA由复旦大学医学院程训佳教授惠赠。FTA卡和FTA卡纯化试剂(英国Whatman公司)，TE Buffer(生工生物工程上海股份有限公司)，TaKaRa Ex Taq酶(宝生物工程大连有限公司)，DNA Marker(天根生化科技北京有限公司)，TBE Buffer(生工生物工程上海股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1光学显微镜检查直接涂片法：加1-2滴生理盐水于洁净的载玻片中央，挑取腹泻病人粪便标本中的可疑部分，在生理盐水中涂抹成粪便薄膜，厚度以透过粪便薄膜能看清字为宜，加盖玻片后显微镜下观察。

碘液染色法：用碘液代替生理盐水，制片方法同直接涂片法，检测是否存在阿米巴原虫的包囊或滋养体。

1.2.2FTA卡提取DNA将镜检结果为阳性的腹泻病人粪便分装于1.5 mL离心管中，95 ℃水浴加热5 min，冷却至室温后滴加于FTA卡上，室温干燥。用打孔器从样品卡上取直径6 mm的小圆片，将其放入1.5 mL的离心管中，加入400 μL FTA卡纯化试剂洗2次，每次浸泡5min。再用TE Buffer洗3次，每次浸泡5 min，将处理后的小圆片于室温或56 ℃晾干。干燥后的FTA卡小圆片可保存于室温。

1.2.3巢式PCR扩增及分析根据E.h的SSU-rRNA序列设计巢式PCR引物[10-11]，外引物分别为： E1(上游引物)5′-TGCTGTGATTAAAACGCT-3′，E2(下游引物)5′-TTAACTATTTCAATCTCGG-3′，预期扩增片段大小为1 076 bp。E.h特异性的内引物的序列分别为：Eh-L(上游引物)5′-ACATTTTGAAGACTTTATGTAAGTA-3′，Eh-R(下游引物)5′-CAGATCTAGAAACAATGCTTCTCT-3′，预期扩增片段大小为427 bp。引物均由上海立菲生物技术有限公司合成。

第1轮PCR反应以处理好的FTA卡小圆片剪碎作为模板，加入10×Buffer 10 μL，25 mmol/L的MgCl28 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)8 μL，10 μmol/L的引物(E1、E2)各4 μL，Ex TaqDNA聚合酶 0.5 μL，ddH2O补足100 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，47 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸2.5 min，35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

第2轮PCR反应以第一轮PCR产物5 μL为模板，加入10×Buffer 5 μL，25 mmol/L的MgCl24 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，10 μmol/L的引物(Eh-L、Eh-R、Ed-L、ED-R)各1 μL，Ex TaqDNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O补足50 μL。退火温度为58 ℃，其余反应条件与第一轮PCR相同。阳性对照模板采用E.h的基因组DNA，同时设立健康人对照、空白对照。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，紫外光下观察电泳条带。选择可扩增出目的条带的PCR产物送上海立菲生物技术有限公司进行目的条带的纯化并测定序列，通过序列比对以验证是否为目的片段。

2结果

2.1阿米巴原虫的检测根据直接涂片法和碘液染色法检测的结果，挑选了44例镜检结果为阿米巴原虫阳性的腹泻病人粪便，图1为碘液染色法观察到的阿米巴原虫包囊。

2.2FTA-巢式PCR扩增用FTA法提取了44例镜检结果为阿米巴原虫阳性的腹泻病人DNA，以此DNA为模板进行巢式PCR扩增，部分电泳结果如图2所示。其中20例样本可扩增出427 bp左右的目的条带(图3)，推测为E.h感染。镜检法与PCR法的阳性符合率为45.45%(20/44)。

A: 镜检阳性，PCR阴性；B: 镜检阳性，PCR阳性

A: Positive for microscopy, negative for PCR; B: Positive for microscopy, positive for PCR

图1碘液染色法

Fig.1Iodine-stain smear

2.3PCR产物测序鉴定分别将测得的DNA片段序列与GenBank中的阿米巴原虫序列进行BLAST比对，结果显示427 bp的DNA片段与溶组织内阿米巴原虫(登录号：AB608092.1)的SSU-rRNA具有高度同源性。根据得分(Score，676)、E值(E value，0.0)和同源性(Identity，99%)，表明本实验扩增获得的PCR产物确实为E.h的片段。

3讨论

寄生于人体消化道内的阿米巴原虫种类很多，除E.h之外还有迪斯帕内阿米巴(E.d)、结肠内阿米巴(Entamoebacoli)、哈门氏内阿米巴(Entamoebahartmanni)、微小内蜒阿米巴(Entamoebanana)、布氏嗜碘阿米巴(Iodamoebabutschlii)和齿龈内阿米巴(Entamoebagingivalis)，但只有E.h具有致病性，在宿主免疫力低下时，可引起急性暴发型阿米巴肠病。E.h、E.d的滋养体直径约12～60 μm，包含1个单核，包囊大小约10～20 μm，未成熟包囊有1～2个核，成熟包囊则有4个核，从形态上难以区分，E.hartmanni包囊通常为6～8 μm，但有时部分E.hartmanni包囊直径会大于10 μm，如果严格根据形态进行检测，即使具有丰富的镜检经验仍可能会将E.hartmanni误认为E.h或E.d，从而造成临床上的误诊，导致耐药性的出现。

M：DNA分子量标准；E1-E24：腹泻病人粪样；N1、N2：健康人粪样；P：阳性对照；B：空白对照

M: DNA marker; E1-E24: Fecal samples of diarrheal patients; N1 and N2: Fecal samples of healthy people; P: Positive control; B: Blank control

图2FTA-巢式PCR产物电泳分析

Fig.2Electrophoresis analysis of FTA-nested PCR products

M：DNA分子量标准；1-20：阳性产物；P：阳性对照；B：空白对照

图4　序列比对结果

PCR技术是近年来发展较快且准确、敏感、特异、高效的诊断方法，在病原检测和生物鉴定方面得到了广泛应用。核酸提取是PCR实验的首要步骤，常规的DNA制备方法操作复杂、费时费力、对实验设备要求高，并且样品中的杂质和提取过程也可能影响检测结果。FTA卡可通过简单的一步法采集捕获DNA，其他的裂解碎片以及PCR抑制因子等均被纯化试剂和洗涤剂洗涤除去，可用于PCR、SNP、RT-PCR、RFLP 以及限制酶解作用的分析。此外，FTA卡携带方便，在室温下可以长期保存，整个过程操作简单、快速、安全，对样品需求量少[12-13]。Nantarisai等[14]比较了商业化试剂盒(QIAamp stool mini kit)、FTA卡和酚-氯仿3种抽提粪便样品中十二指肠贾第虫DNA的方法，结果表明FTA法是一种高效的DNA提取方法，具有操作简便、灵敏度高、可同时处理多个样品且便于运输保存等优点，FTA-PCR方法检测粪便中的十二指肠贾第虫与IFA方法检测的敏感性和特异性无显著差别。张小萍等[15]用FTA卡提取隐孢子卵囊DNA，检测水源中的隐孢子虫，阳性样品均扩增出约446 bp的特异性片段，表明FTA-PCR可用于水样中隐孢子虫污染的基因检测。此外，FTA-PCR方法还可检测粪便、水产品等不同来源样品中的寄生虫[16-17]。

本实验直接将镜检阳性的粪便样本95 ℃加热破坏包囊壁，冷却后点样于FTA卡上，再通过简单的后续处理即可获取粪便中的DNA，并根据阿米巴原虫的小亚基核糖体RNA(SSU-rRNA)序列设计引物，建立了FTA-巢式PCR方法以鉴定E.h。研究结果表明，镜检结果为阿米巴原虫阳性的44份腹泻病人样品中有20份样本可扩增出目的条带，经BLAST序列比对均为E.h的rRNA片段。其余24份样本经过2次重复的FTA-巢式PCR验证，仍未扩增出E.h的特异性条带，推测为其他种类的阿米巴原虫感染或非特异性肠炎。由于从形态上难以区分E.h、E.d等内阿米巴原虫，且阿米巴肠病与非特异性溃疡性结肠炎、克罗恩病、慢性肠炎和细菌性痢疾临床症状相似，尤其伴黏液血便、果酱样便的患者，镜检可能将白细胞、巨噬细胞等与阿米巴原虫相混淆，出现误诊，扩大了E.h的感染率。Rodulfo H等[18]发现150例镜检为溶组织内阿米巴阳性的粪便样品中，经巢式PCR验证仅14%为E.h阳性。Nqui R等[19]共检测了426例粪便样品，镜检发现75例为阿米巴阳性，巢式PCR结果显示镜检阳性的粪样中39例(39/75)为E.h阳性。上述研究均表明，仅用镜检方法进行E.h的检测会存在不同程度的过度诊断。本研究的结果也证实了这一点，镜检阳性的44例粪样中有20例经PCR验证为E.h阳性，镜检与FTA-巢式PCR的阳性符合率为45.45%(20/44)，与已有的报道[20]相一致，表明该方法与普通巢式PCR的敏感性相同，可以将E.h与其他阿米巴原虫进行鉴别和区分。

本研究建立的FTA-巢式PCR方法具有简单、快速、可靠等优点，可以特异性地区分形态学上非常相似的E.h与其它消化道内阿米巴原虫，并可鉴别诊断阿米巴肠病与非特异性肠炎、细菌性痢疾等疾病，可作为鉴定致病性溶组织内阿米巴(E.h)感染的辅助诊断方法。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.006

通讯作者：陈韶红，Email: chensh637@163.com

Corresponding author:Chen Shao-hong, Email: chensh637@163.com

中图分类号：R382

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)02-0128-05

收稿日期：2015-01-23；修回日期:2015-06-12

Identification of Entamoeba histolytica by FTA-nested PCR

LU Yan,CHEN Jia-xu,ZHANG Yong-nian,LI Hao,CHU Yan-hong,AI Lin,CAI Yu-chun,CHEN Shao-hong

(National Institute of Parasitic Diseases, Chinese Center for Disease Control and Prevention; Key Laboratory of ParasiteandVectorBiology,MOH;WHOCollaboratingCenterofMalaria,SchistosomiasisandFilariasis,Shanghai200025,China)

Abstract:To establish a simple and rapid FTA-nested PCR method for identification of the Entamoeba histolytica (E.h), the fecal samples of diarrheal patients were collected. The samples were examined with a microscope firstly, and 44 positive samples were selected. The genomic DNA of Entamoeba in positive samples was extracted by FTA filters. Primers were designed based on the SSU rRNA fragment of E.h and the plate DNA was amplified by nested PCR. All PCR products were detected by agarose gel electrophoresis, and then the target fragments were sequenced and analyzed by BLAST. The 427 bp fragment of DNA was detected from 20 fecal samples. Sequence analysis of 20 target fragments amplified by nested PCR showed that they were E.h. The consistent rate of microscopic examination and nested PCR was 45.45% (20/44). This nested PCR could identify and differentiate the pathogenic E.h from the non- pathogenic Entamoeba species which were morphologically identical (similar). It suggested that FTA-nested PCR is a simple, rapid and reliable technique for identifying E.h in human stool samples, and provided a new technical method for differential diagnosis of E.h in clinical examination and epidemiological survey.

Keywords:Entamoeba histolytica; FTA; nested PCR; identification

卫生行业科研专项(No. 201202019)和国家科技重大专项(No. 2012ZX10004-220)联合资助

Supported by Special Fund for Health Research in the Public Interest (No. 201202019) and the National S & T Major Program (No. 2012ZX10004-220)