镁锶合金修复兔桡骨骨缺损的实验研究*

葛野 李世慧 李建军* 谭丽丽 万鹏 韩君杰 杨柯

论著·实验研究

镁锶合金修复兔桡骨骨缺损的实验研究*

葛野1李世慧1李建军1* 谭丽丽2万鹏2韩君杰2杨柯2

目的研究Mg-Sr合金对兔桡骨骨缺损的修复效果。方法将30只新西兰大耳白兔随机分为Mg-Sr合金组和空白对照组两组，每组15只。手术制备双侧桡骨中段1.0cm骨缺损模型，镁锶合金组缺损部位植入Mg-Sr合金；空白对照组不植入任何材料作为对照。两组分别于术后4、8和12周各处死5只动物取材，行X线片、组织学检查及Micro-CT，观察各组对骨缺损的修复效果。结果Mg-Sr合金组骨缺损得到了修复，空白对照组仅有少量新骨形成，但骨缺损未得到修复。结论Mg-Sr合金对兔桡骨骨缺损有很好的修复效果。

Mg-Sr合金；骨缺损；修复

骨缺损是骨科多发病与常见病，由创伤、感染、肿瘤等原因导致的大块骨缺损常需要骨移植或骨修复材料的使用等方能临床治愈[1]。自体骨因其无免疫排斥反应、生物相容性好、成骨能力强以及骨诱导活性高等优点是临床最常用亦是最有效的骨移植材料。但因可供骨源有限，额外增加手术创伤及手术时间，取骨区常出现疼痛、感染等并发症，自体骨的应用受到限制[2,3]。同种异体骨移植较自体骨而言来源丰富，用深低温冷冻、冷冻干燥及化学处理等方法处理后可于骨库中保存异体骨[4-6]，但异体骨移植后出现的免疫反应、感染、骨诱导不良等并发症干扰了骨愈合效果[7]。研究及开发各种人工骨材料，以克服自体骨移植及异体骨移植各固有的缺点，是目前骨科基础及临床研究亟需解决的问题。有研究者提出，理想的骨移植材料应具备以下特点：良好的生物相容性，生物可降解性及可吸收性，骨诱导性，骨传导性[8-10]等。

镁（Mg）是人体必需的元素，在支持和维持健康和生命中扮演着重要的角色[11]，是参与DNA及RNA合成与复制，蛋白质合成过程中的重要元素[12]。Mg是人体新陈代谢及骨组织中的基本元素，人体内的镁50%～60%分布于骨组织中。Mg参与体内一系列新陈代谢过程，包括骨细胞的形成及加速骨愈合等[13,14]。因此，Mg及Mg合金因其良好的生物相容性，生物安全性，可降解性，弹性模量与密度与正常骨组织相接近等性能广泛应用于生物医用植入材料的研究[15,16]。然而纯镁降解速度快，耐腐蚀性差，在植入部位产生大量气体等缺点限制其作为植入材料在人体内的使用。研究表明，在Mg金属中加入合金材料可提高Mg的力学性能和抗腐蚀性[16,17]。传统的Mg合金一般含有Al、稀土[18,19]等元素。然而研究发现，Al有神经毒性，对胎儿有致畸致残及致血液系统疾病等不良反应[20]；稀土元素可产生神经毒性及肝毒性等[21,22]。因此，添加低毒或无毒元素的Mg合金成为骨移植物的重要研究方向。锶（Sr）是人体必需微量元素，99%存在于骨骼中，Sr有促进骨质形成改善骨结构及治疗骨质疏松的作用，在人体骨代谢中扮演重要角色[23,24]。研究发现，添加一定质量分数Sr的Mg合金耐腐蚀性好，生物相容性好，细胞毒性小，力学性能佳。Mg-Sr合金将成为镁合金研究及骨科临床应用中极具前景的方向[25,26]。微弧氧化处理Mg合金表面可改善镁合金的耐腐蚀性，改善降解速度，提高成骨细胞吸附性且具有良好的生物相容性[27]。适当孔径的多孔Mg合金力学性能更接近天然骨组织，利于骨愈合[28]。

笔者选用新西兰大耳兔为研究对象，制备双侧桡骨中段1.0cm骨缺损模型，采用微弧氧化多孔Mg-Sr合金植入修复骨缺损，并与空白对照组对照。术后观察实验动物的一般情况，分别于术后4、8及12周拍摄双侧前肢正位X线片，取缺损部位行病理切片HE染色，取缺损部位骨组织及植入物行Micro-CT检查用以观察骨缺损区新骨形成情况，植入物吸收程度，Mg-Sr合金的生物降解程度，生物相容性等。探讨Mg-Sr合金在骨缺损修复中的作用，为Mg-Sr合金作为骨替代材料应用于临床提供理论基础与实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

微弧氧化多孔Mg-Sr合金块（98.5wt%Mg-1.5wt%Sr）（由中科院金属研究所提供），尺寸2mm×3mm×10mm。健康新西兰大耳白兔30只，雌雄不限；体重2.0～2.2kg（由沈阳军区总医院动物实验中心提供）。以标准饲料和饮用水喂养，室温20～25℃。动物饲养及实验过程遵照《实验室动物饲养和使用条例》。

1.2 实验动物制备及分组

健康新西兰大耳白兔30只，雌雄不限；体重2.0～2.2kg。采用3%戊巴比妥纳（30mg/kg）肌注麻醉，麻醉后实验兔取仰卧位，并用约束带固定四肢，后备皮并消毒铺巾。手术切口沿兔前臂桡侧切开长约5cm切口，逐层分离筋膜及肌层暴露桡骨，并用骨锯截除桡骨中段包括骨膜，后取双侧桡骨中段包括骨膜截除1.0cm制成骨缺损模型。随机分为2组，每组15只。A组Mg-Sr合金组；B组空白对照组。通过紧密缝合肌膜和筋膜固定移植Mg-Sr合金块。给予切口大量0.9%氯化钠注射液冲洗，并缝合切口后，分笼饲养。术后3天预防感染治疗，青霉素80万u，日二肌注，10天后拆线。各组在术后4、8和12周各处死5只动物取材，进行观察。

1.3 观察指标

1.3.1 大体观察

术后观察实验动物的一般情况，包括进食、活动状况、体重改变，创口是否有红肿、溢脓、瘘道出现，创口愈合情况等。

1.3.2 X线片

于术后各时间点拍摄双侧前肢正位X线片，观察骨缺损区新骨形成情况并采用图像分析软件分析新生骨在骨缺损区域所占面积。

1.3.3 组织学观察

各组各时间点随机处死5只动物，取缺损部位标本多聚甲醛固定，石蜡包埋，沿纵轴切片，HE染色，于光学显微镜下观察骨痂生长情况，缺损部位成骨细胞活性。

1.3.4 Micro-CT观察

Mg-Sr合金组于术后各时间点处死动物，截取骨缺损部位，多聚甲醛固定24～48小时，在Micro-CT下观察骨痂生长情况，Mg-Sr合金降解程度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示；方差分析比较组间差异。为有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

术后实验动物的一般情况良好，术后前2天进食稍差（考虑与术后疼痛有关），之后进食良好。活动状况良好、体重无明显改变，创口无红肿、溢脓、瘘道出现，创口于术后1周左右愈合。

2.2 X线片

X线片可见A组术后4周时缺损骨内片状成骨影，8周时骨缺损部分修复，12周时皮质骨连续，金属外有连接骨桥形成，可见部分髓腔再通。B组4周和8周时缺损区内少量成骨影，12周骨端硬化，髓腔闭塞（见图1）。

图1 各组各时间点X线片

2.3 图像分析新骨面积

采用图像分析软件分析X线片各组新生骨在骨缺损区域所占面积，可见A组不同时间点组间差异有统计学意义各时间点与B组比较，差异均有统计学意义05）（见表1）。

表1 各组各时间点修复新生骨占骨缺损面积比

表1 各组各时间点修复新生骨占骨缺损面积比

注：#A组不同时间点比较，*A组与B组比较

2.4 组织学观察

A组术后4、8周时可见大量成骨细胞形成（HE×100），术后12周时见骨细胞成熟，核膜清晰。B组成骨细胞明显少于A组（见图2，彩图见插页）。

图2 两组病理切片HE染色

2.4 Micro-CT观察

Micro-CT可见A组术后4周缺损部位Mg-Sr合金周围有少量骨痂形成，术后8周Mg-Sr合金部分降解、骨痂量增多，术后12周缺损部位Mg-Sr合金的降解速度与骨修复速度相适宜，Mg-Sr合金完全被骨痂包裹，可见部分髓腔相通。（见图3）

图3 Micro-CT图像

3 讨论

在本世纪初期，Mg基金属因为其可降解的生物特性，代表了新一代医用材料的出现，在各界得到了人们的广泛研究。这类新型医用金属替代物灵活地利用Mg基金属材料（纯镁及Mg合金）在体内容易降解的特点，利用金属植入物在体内不断降解直至被完全吸收，从而避免内置物取出所带来的二次手术伤害的医疗临床目的。然而纯镁降解速度快，在体内快速降解并在植入部位生成大量H2等缺点限制其作为骨替代材料在人机体的使用。而在Mg金属中加入其它金属可改善镁的力学特性和抗腐蚀能力。并且，因为Mg基金属材料特点，以至于在抗压性、可塑性方面要强于已在临床广泛应用的陶瓷、硫酸钙等骨替代物，同时因为弹性模量和密度更接近骨组织，所以作为骨替代材料有非常广阔的临床应用空间[15,16]。

有研究者提出，完美的骨替代材料应拥有良好的生物可降解性及可吸收性，生物相容性，骨诱导性，骨传导性等[8-10]。

过慢降解的替代品不能被吸收和骨取代，并可妨碍全骨再生。而降解过快的替代材料则不能在骨修复重建的全过程中起到支撑作用。而Mg降解在体内会形成高碱度和不断生成的H2，这将进一步影响骨和伤口愈合[29]。在笔者前期与中国科学院金属研究所共同研究Mg-Sr合金体外实验中，通过动电位极化的方法来评估Mg-Sr与纯镁耐腐蚀性能，随着Sr含量的增加，Mg-Sr合金自由腐蚀电流（电流密度）显著下降，明显低于纯镁组，由此证明Mg-Sr合金组耐腐蚀的性能比纯镁组高2～3倍；而微弧氧化处理Mg合金表面可改善Mg合金的耐腐蚀性，改善降解速度，提高成骨细胞吸附性且具有良好的生物相容性；在生物力学方面，与商业用骨移植替代物相比，Mg-Sr合金的力学性能更接近皮质骨，并且其抗压强度可达300MPa，表明其承重骨缺损填充的应用潜力；而适当孔径的多孔Mg合金力学性能更接近天然骨组织，利于骨愈合[30]。在体内实验中，Sr作为合金元素的加入，由于金属间的相互作用有助于沉淀加固和减少电化腐蚀[26]。在本次体内实验中，Mg-Sr合金组，在整个骨修复过程中，未发现明显的气体产出，整个降解过程与骨修复过程相适宜，并在整个修复过程中，保证良好的支撑作用。由此证明Mg-Sr合金在生物降解性、耐腐蚀及生物力学方面的优势。

几乎所有的骨移植替代品均拥有骨传导性能，但没有成骨诱导活性。常用的改进骨诱导方法是将脱钙骨基质，BMP，生长因子融合在一起。而Mg基金属可通过刺激骨细胞生长加速骨组织愈合过程[31]。Mg也是一种人体新陈代谢的基本要素，使用时在体内降解的Mg可以无毒和经尿排出[32]。Sr也是人体必需元素，其中98%存在于人体的骨骼中。据报道，口服补充Sr可以改善椎体骨密度和刺激骨形成[33]。顾等[29]还证明了Sr对成骨细胞的增殖与分化有刺激作用。此外，Sr还能抑制破骨细胞分化并有助于防止骨吸收[31]。在笔者的前期体外实验中[30]，通过培养液中（改良的伊格尔培养基）的鼠前成骨细胞活性的比较，发现所有的Mg-Sr合金均没有毒性，并且Mg-xwt%Sr（x=1.0，x=1.5，x=2.5）细胞存活率达到100%，且细胞增殖率远高于纯镁组。这表明Sr的加入明显的改善了细胞的增殖，并表现出了极好的细胞相容性。其中，以1.5wt%Sr表现出最好的细胞活性和0级的细胞毒性。在笔者本次体内实验中，笔者通过X线、Micro-CT及HE切片染色发现，其中X线、Micro-CT显示4周时缺损部位Mg-Sr合金周围有少量骨痂形成，术后8周Mg-Sr合金部分降解消失、骨痂量增多，术后12周缺损部位Mg-Sr合金的降解速度与骨修复速度相适宜，Mg-Sr合金完全被骨痂包裹，并可见部分髓腔相通。空白组4周和8周成骨影不明显，12周骨端硬化，髓腔闭塞。而且通过图像分析软件分析X线片各组新生的骨组织在骨缺损区域所占百分比，可见Mg-Sr合金组、空白组不同时间点组间差异有统计学意义各时间点比较，Mg-Sr合金组差异均有统计学意义Mg-Sr合金组4、8周时成骨细胞生成较多，并向皮质骨改建（HE×100），12周时见骨细胞成熟，核膜清晰。而空白组4周、8周时可见少量编织骨形成，较Mg-Sr合金组少。说明Mg-Sr合金有良好的骨诱导性，可降解吸收性，降解速度与骨修复速度相适宜。

可见，Mg-Sr合金可作为良好的骨科替代材料用于骨缺损等骨科疾病的治疗。因此，笔者今后主要研究方向是把Mg-Sr合金植入到多种类型骨折的动物模型中，并进一步观察Mg-Sr合金对机体的远期影响，为进行人体实验做准备。相信不远的将来，Mg-Sr合金一定会成为新型的骨移植产品而大量在临床上使用。

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Experimental study on the repair of rabbit radius bone defect with Mg-Sr alloy

Ge Ye1,Li Shihui1,Li Jianjun1,et al.1 Department of Orthopedics,Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang Liaoning,100004；2Institute ofmetalresearch,ChineseAcademyof Sciences,Shenyang Liaoning,110016, China

Objective To study the effect of Mg-Sr alloy on the repair of radial bone defect in rabbits.Methods 30 New Zealand white rabbits were randomly divided into two groups:Mg-Sr alloy group and blank control group,with 15 rabbits in each group.The 1.0cm bone defect model of bilateral radial bone was made by operation,and the Mg-Sr alloy group was implanted with mg SR alloy into the defect site,the blank control group was not implanted with any material as control.5 animals of each group were killed at 4,8 and 12 weeks respectively after operation,and the repair effect of bone defect were observed by X-ray,Micro-CT and histological examination.Results The bone defect was repaired in the Mg-Sr alloy group;only a few new bone formation was observed in the control group,the bone defect was not repaired.Conclusion Mg-Sr alloy has a good effect on repairing bone defect of radius in rabbits.

Mg-Sr alloy;Bone defect;Repair

R318.08

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.05.001

swgk2016-03-00053

葛野（1983-）男，硕士在读。研究方向：骨组织损伤与修复。

辽宁省自然科学基金（编号：20102264）

1中国医科大学附属盛京医院骨科，辽宁沈阳110004；2中国科学院金属研究所，辽宁沈阳110016