小口径电纺组织工程血管支架的研究进展

杨锦秀　综述　何乐人　审校

小口径电纺组织工程血管支架的研究进展

杨锦秀综述何乐人审校

【提要】小口径血管是组织工程血管领域的重要部分，临床实用性强。小口径血管支架的合成是构建小口径人工血管的基础，而电纺技术作为一种新型的组织工程材料制备技术，可利用高压静电场产生微米级甚至是纳米级的纤维，再经过一系列加工处理，形成类似细胞外基质的结构，刺激细胞的黏附和增殖。本文对小口径电纺组织工程血管支架的相关材料、制备工艺、表面修饰和评价进行综述。

【关键词】电纺组织工程血管支架小口径

目前，临床上常用的血管移植物主要包括自体血管、异体血管和人造血管，在实际应用中各有利弊。自体或异体血管的来源有限，同时造成供区损伤；人造血管，如涤纶、膨胀聚四氟乙烯等，已成功应用于大血管的替换，但在直径<6 mm的小口径血管移植应用中并不理想[1]，常因血流速度慢、灌注压低，而出现内膜增厚、血管狭窄、血栓形成、感染等情况，导致远期通畅率低。理想的小口径血管移植替代物的制备，仍是血管移植和组织修复领域亟待解决的难题。

近年来，生物新材料的不断涌现，以及制备工艺的不断创新，为合成具有更加优良生物学性能的组织工程血管（Tissue Engineering Blood Vessel，TEBV）奠定了基础。TEBV是指利用正常血管壁的细胞和ECM成分重建或再生的血管，其中支架材料及其制备方法是组织工程血管发展的重要制约因素之一。目前，相关支架的制备方法主要包括静电纺丝法、溶液浇筑浸渍法、细胞自组装法和热致相分离法等。

静电纺丝（电纺，Electrospinning）是一种新型组织工程材料制备技术，其原理是利用高压静电场产生微米级甚至纳米级的纤维。该方法由Formhals[2]首次报道，并在本世纪初应用于组织工程血管支架（Tissue Engineering Blood Vessel Grafts，TEVGs）的制备。静电纺丝法制备的材料具有孔隙率高、比表面积大、机械性能良好等特点，理论上可较好地模拟细胞外基质（ECM）结构，有利于血管内皮细胞的黏附和增殖[3]。因此，该方法在小口径组织工程血管的研究中具有较强的技术优势和广阔的应用前景。

1　电纺TEVGs的材料

合成电纺支架的材料主要有三大类：天然大分子材料、可降解聚合物材料和复合材料。

1.1天然大分子材料

天然大分子材料是由生物合成的有机大分子物质，如胶原（Collagen）、丝素蛋白（Silk fibroin）、弹性蛋白（Elastin）、明胶（Gelatin）和壳聚糖（Chitosan）等。这些材料通常含有促进细胞黏附、增殖的识别信号分子，组织相容性好，免疫排斥反轻微。植入体内后逐步降解，终产物一般为H2O、CO2等可被人体吸收的无毒小分子。

丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70%～80%,具有良好的机械性能和理化性质，如一定的柔韧性和抗拉伸性、透气透湿、释放缓慢等。研究表明，丝素蛋白具有较好的生物相容性，适宜细胞附着、延伸和增殖，是有前景的支架生物材料之一[4-5]。Soffer等[6]成功利用电纺技术将丝素蛋白制备成直径5 mm的血管支架；Marelli 等[7]利用丝素蛋白制备出直径6 mm的纳米管状支架，动物实验表明该支架的生物相容性良好。

胶原蛋白和弹性蛋白是天然细胞外基质的主要成分，对正常细胞的生长与依附具有重要作用，可将其用于制作小口径组织工程血管。Boland等[8]曾使用电纺方法制备出胶原蛋白和弹性蛋白混合纳米纤维支架，表明两种甚至多种材料混合形成小口径血管支架在技术上具有可行性。

但是，实验及应用研究发现，天然大分子材料在力学性能上存在缺陷，很难在生理状态的血压下长期维持三维管状形态，在血运丰富的区域，高流速的灌注血流可使其发生破损或断裂；另外，降解速率过快，难以匹配组织工程血管的形成时间，导致血管构建的失败[9]。

1.2可降解聚合物材料

可降解聚合物材料与生物材料相比具有良好的机械性能，易于加工、可控性强，可根据实际需求制作出不同形态、不同机械性能的支架。另外，可降解聚合物支架可设定分解速率，最终随组织的再生而完全降解，且基本避免了免疫排斥反应。目前这种材料的研究较多，其特性适用于小口径电纺组织工程血管的制备。常用的可降解聚合物材料主要有聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）、PGA和PLA共聚体 PLGA （Poly lactic-co-gly colic acid）、聚己内酯 （PCL）、聚乙烯醇（PVA）和聚羟基丁酸酯（PHB）等。

西方歌剧发展至今经久不衰，正是因为有这些歌剧改革者的不懈努力，有了他们的紧跟时代的创作，才留下了这么多历久弥新的经典歌剧，虽然这三位作曲家远远不能概括欧洲歌剧的发展，但我们可以从中窥探到歌曲发展到今天的不易，了解到了歌剧艺术发展的辉煌历程。

Mo等[10]将PLLA与PCL两种聚合物材料溶于丙酮溶液，利用混合电纺技术制成P(LLA-CL)血管支架，并接种人管状动脉平滑肌细胞，支架移植成功且远期通畅率尚可。之后，Petok等[11]将PCL溶于三氯甲烷与乙醇的混合溶液中，利用电纺技术制造出直径2 mm的血管支架，并植入大鼠体内，6个月后解剖发现支架仍保持了完整的结构。

可降解聚合物材料具有较好的可控性及机械性能，并在一定程度上弥补了天然材料的缺陷，但同时也存在一些需要解决的问题，如部分材料的细胞亲和不佳、亲水性和细胞黏附力较差，容易造成局部的无菌炎症反应等。

1.3复合材料

复合材料是天然大分子材料与可降解聚合物材料按一定比例组合形成的新型材料。天然大分子有良好的生物相容性，易于细胞的粘附与增殖，而可降解聚合物材料具有较好的机械性能和可控性。这两种材料相互补充，利用彼此的优点所形成的复合材料，更能满足电纺组织工程血管支架的需要，是未来这一领域的主要发展方向。近十年来小口径电纺组织工程血管支架的进展概况见表1。

表1　小口径电纺组织工程血管支架的进展概况

2　小口径电纺TEVGs的制备

2.1制备原理

电纺技术制备的小口径血管支架是在数万伏电压作用下，使高聚合物的溶液或熔融体带上电荷，随着电场强度的增加，电荷达到临界，静电斥力使溶液克服表面张力形成喷射细流；溶剂在喷射过程中挥发，通过不同口径的旋转轴心收集装置得到定向或随机排列的纳米纤维管。该方法可产生模仿生理血管形态和机械性能的圆管状支架结构[20]。

2.2制备方法

电纺制备小口径血管支架的主要方法有单一材料电纺、共混电纺、同轴共纺及特殊制备法等。

单一材料电纺是指以单种高分子聚合物为电纺材料，存在降解快、生物相容性差等问题，难以适应临床需求。

以上两种均为传统电纺方法，所制备的血管支架是单层结构，缺乏部分生理及力学功能。同轴共纺由传统方法改进而来[21]，其特点为两种或两种以上的电纺材料形成的纳米纤维呈“壳-芯”结构。该方法沿用了传统方法的原理，但是在制作工艺上模仿了人体正常血管内、中、外膜的三层结构，将互不相溶的芯层和壳层材料溶液分别装入不同注射器中，利用喷丝系统中两个同轴的毛细管，使其以适当的流速通过该喷丝装置，壳层液体流出与芯层溶液汇合，形成同心分层流，在同一电压下通过同轴静电纺丝得到“壳-芯”结构纳米纤维[22]。Zhang等[12]利用同轴共纺法制备了胶原-PCL壳-芯纳米纤维支架，体外实验对比发现，该结构支架可促进细胞黏附增殖，具有良好的机械性能，其结构更加接近于天然的ECM。

除了上述一些常见的合成方法外，还有一些研究探索了种子细胞接种与支架合成相结合的方法。Wagne等[23]在电纺制备纳米纤维血管支架的同时，将细胞悬液通过电喷雾直接种植于支架表面。还有的研究在两层电纺支架中种植一层细胞，重复进行，形成支架-细胞-支架结构的多层电纺血管支架。Vaz等[13]应用层-层电纺技术，将PCL和PLA组成双层血管支架（长2 cm，内径6 mm，约600 μm厚）。外层由强度较硬、规则排列的PLA纤维组成，模拟血管的外纤维层，内层由弹性较强、排列不规则的PCL纤维构成。通过模拟正常血管的形态和力学特性，有效地提高了TEBV的机械强度。

3　小口径电纺TEVGs的表面修饰

为了给细胞提供更加适宜的生长环境，除了要设计好支架的直径、材料和结构外，还需要对支架进行表面修饰，即在支架的表面添加一定的物质来增加细胞的黏附、促进细胞增殖和分化。支架表面与细胞直接接触，可对细胞应答和组织修复产生影响，因此表面修饰已成为支架制备中不可或缺的步骤之一。长久以来，一些小口径血管支架研究未能达到预期的主要原因就在于移植后血管内血栓引起血管再狭窄，支架的表面修饰在一定程度上可以解决该问题。

现已建立了多种表面接种与表面修饰技术，包括将各种细胞因子，如血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板衍生因子（PDGF）、黏附多肽及一些氨基酸残基序列（RGD序列，Arg-Gly-Asp）等结合于支架表面，增强种子细胞的黏附、生长及组织构建能力[24]。不同的细胞因子的作用不尽相同，其中VEGF支架可有效促进支架表面细胞的内皮化，PDFG支架趋化中性粒细胞与成纤维细胞，参与血管的形成，RGD序列蛋白支架可通过促进血管内皮细胞的黏附，模拟生理条件下的血管内层功能。此外，通过内皮化或肝素化可使支架具有一定的抗凝功能。内皮化是将内皮细胞黏附于支架表面，加速支架结构内皮化进程，使血管保持通畅从而防止血栓形成[25]。使用抗凝药物肝素或其类似物固定于支架材料表面可以抑制血管阻塞。对不同的实验或临床研究，选用合适的表面修饰物质进行筛选和鉴定，在保证安全性的基础上使材料的效果达到最佳。

4　小口径电纺TEVGs的评价

植入体内的组织工程血管支架必须满足以下基本条件：无毒副作用、无刺激性、无致敏性，对人体各系统无潜在损伤且性能稳定。理想的电纺小口径血管支架则要经过一系列生理和机械性能评价，符合一定标准后才能作为移植物在人体中使用。

4.1生理功能评价

4.1.1生物相容性

生物相容性包括组织相容性和血液相容性，一般认为材料的生物相容性与植入体内的安全性成正比。在制备血管支架后，有必要设计科学、合理而又准确的实验，对支架的生物相容性进行统一的评价。评价主要包括形态学观察，胶原蛋白、肌动蛋白、肌钙蛋白和肌球蛋白表达量测定，细胞间黏连分子、层黏连分子表达测定，von-Willebrand因子、血小板内皮细胞黏附因子和组织因子受体检测，细胞外基质蛋白释放能力、细胞活性和新陈代谢评估等[26]。

4.1.2可降解性

组织工程血管的支架材料需要具备生物降解能力。在理想状态下，支架整体降解速度应与移植组织的再生速度基本一致，这样才能保证完整的组织再生。对于小口径血管，支架在血管内皮化完成后降解可以保持正常血管的结构完整和内环境稳定，降低支架内壁形成血栓的风险。PLA、PGA和PLGA等聚合物降解周期较长，在小口径人工血管支架中具有一定优势。

4.2机械性能评价

4.2.1孔径及孔隙率

小口径人工血管支架的孔径、孔隙率与排列方式等参数影响细胞的生物活性。当孔隙率达90%、孔径为100～300 μm时，最有利于细胞黏附与基质合成。渗透性由支架的孔度及孔隙率决定，渗透性过大将增加术中血液渗漏的发生可能，并与术后血肿等并发症密切相关，影响移植血管的愈合能力。

4.2.2机械强度

小口径组织工程血管需要能够承受一定的缝线牵张拉力和血液灌注压力，要求血管支架具备一定的机械强度。机械强度应包括轴向拉伸强度、血管爆破强度及缝合强度。因小口径组织工程血管的直径等理化参数不一，目前对支架机械强度各项指标并未形成统一的标准。

轴向拉伸强度：体内正常血管在承受血压波动时（约80～ 120 mmHg）易发生形变，分别为轴向形变与圆周形变，轴向形变通常代表血管支架的轴向拉伸强度。爆破强度：爆破强度是指连续通过液体或空气对血管支架施加压力，测得的样本突然破裂时的最大压力。主要方法有薄膜劈裂强度法、探头破裂强度法和加压破裂强度法等。其中最常用的方法为加压法，可以直观、真实地反映移植入体内的血管的抗压能力。缝合强度：移植的人工血管与体内正常血管的成功吻合需要手术缝线缝合完成，因此两者缝合边缘必须能够抵抗术中缝线的牵拉而不出现破漏或破损。测量方法为沿轴向截取一段支架，将其一端拉直，以缝线在样品另一端的边缘内2 mm处穿过，缝线以50～200 mm/min的速度拉伸，记录缝线拉出致使血管壁损伤的拉力大小及缝线尺寸。

4.3顺应性

顺应性是指在正常舒张压下，人工血管管腔内压力作用引起的管壁扩张程度。组织工程血管支架顺应性过小会限制血流通过，造成血管管腔内狭窄，导致移植失败[27]。

5　小口径电纺TEVGs的挑战

组织工程血管的迅速发展，为临床组织缺损及血管损害的修复提供了更好的选择。静电纺丝技术在生物工程领域的不断深入，为小口径人工血管的合成提供了新的方法。目前组织工程血管主要应用于心外科或血管外科，多使用单根大血管的替换。创伤修复与局部器官移植、再造中，需要小口径的血管替代物，通过电纺技术合成支架，选取来源合适的细胞作为种子细胞，可尝试构建适宜的血管移植物。目前在电纺技术应用过程中仍存在一些需要解决的问题：如何进一步提高支架的表面性能，减少对种子细胞黏附与增殖的负面影响；如何设计和选择不同种子细胞种植时的相应最佳孔隙率；支架内机械强度、降解速率的优化与平衡等。随着电纺技术在组织工程领域中的不断发展与进步，会有更多性能优良的支架结构和合成方法出现，对促进小口径组织工程血管的构建并最终用于临床提供帮助。

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【中图分类号】Q813.1+2

【文献标识码】B

【文章编号】1673－0364（2016）03－0191－04

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.014

基金项目：首都临床特色应用研究（Z12110700100000）。

作者单位：100144北京市中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院整形七科。

通讯作者：何乐人（E-mail：heleren@sina.com）。

收稿日期：（2016年2月16日；修回日期：2016年4月20日）

Research Progress in Small-Diameter Tissue Engineering Blood Vessel Grafts by Electrospinning

YANG Jinxiu,HE Leren.The Seventh Plastic Department,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100144,China.Corresponding author:HE Leren(E-mail:heleren@sina.com).

【Summary】The preparation of small-diameter blood vessels is an important part in the field of tissue engineering blood vessels,which has strong practicability in clinic.Synthesis of small-diameter vascular grafts is the basic of the construction of small-diameter artificial blood vessels.Electrospinning is a new technology of tissue engineering preparations.It can use a high voltage electrostatic field to produce micron grade even the nanoscale fibers.And through a series of processing,making the grafts simulate to extracellular matrix,cell adhesion and proliferation can be stimulated.In this paper,the materials, preparation technics,surficial decorations and evaluation system of the small-diameter tissue engineering blood vessel grafts were all reviewed.

【Key words】Electrospinning;Tissue engineering blood vessel;Grafts;Small-diameter