SD大鼠颅缝细胞不同时期GPC3基因表达变化的研究

张策　沈映勋　曹德君

·论著·

SD大鼠颅缝细胞不同时期GPC3基因表达变化的研究

张策沈映勋曹德君

【摘要】目的探索GPC3基因在颅缝组织和细胞中不同时期的表达情况，为后续的疾病模型研究提供参照。方法研究并观察1 d、3 d、7 d的SD大鼠颅缝细胞组织，应用组织切片免疫荧光染色、RT-qPCR、Western Blot等方法，检测其在不同年龄SD大鼠中的表达水平，判断其与颅骨成骨及颅缝闭合的关系。结果免疫荧光显示，GPC3在大鼠未闭合颅缝组织不同阶段胞内、细胞表面及胞外均有表达；RT-qPCR、Western Blotting结果显示，GPC3基因表达随着大鼠年龄增长呈现下降趋势。结论SD大鼠中，GPC3与颅缝闭合密切相关。

【关键词】颅缝细胞SD大鼠磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3

约1/2 500的新生婴幼儿中会出现一条或者多条颅缝提早闭合的现象，称为颅缝早闭症[1]，其发病率仅次于唇腭裂畸形。因为颅缝提前发生骨性闭合，会产生一系列临床表现，如颅腔狭小、颅面骨畸形、颅内压增高等，以及一些复杂的颅颌面畸形综合征，如Crounzon综合征、Apert综合征等。严重者可引起脑发育受阻及智力发育障碍，严重影响患儿的正常发育、生理功能，甚至危及生命。目前，针对颅缝早闭症的治疗仅有手术一种方法，但风险高、费用高，且效果不理想。因此，亟需开展颅缝发育过程中调控机制与机理的研究，为探寻更好的治疗方法奠定基础。

颅缝早闭症是一类由相关基因突变导致的疾病，其中约有20%已经确认了相关发病基因：FGFR2突变 （Apert、Crouzon和Pfeiffer综合征），FGFR3突变 （Muenke综合征），MSX2（Boston型综合征），TWIST1（Saethre-Chotzen综合征）等。Coussens等[2]发现，除 FGFR1～3等，还包括一系列与颅骨发育、颅缝闭合（成骨分化、转录、信号转导、骨塑形、细胞周期、细胞凋亡）相关的新基因。研究表明，受累颅缝与正常颅缝相比，视黄醇结合蛋白-4（RBP4）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）、C1Q肿瘤坏死因子相关蛋白-3（C1QTNF3）均表达下调，其中GPC3下调7倍，提示GPC3基因在颅骨发育、颅缝闭合中可能存在调控作用。

GPC3，为蛋白聚糖（PGs）家族成员之一。蛋白聚糖作为细胞外基质主要成分之一，是一种大分子物质，可以结构性及功能性调节细胞的增殖、分化及基因表达。PGs由核心蛋白及一个或者多个葡糖氨基葡聚糖侧链组成，可以分为硫酸肝素PGs（HSPGs）、硫酸皮肤素或软骨素PGs（CSPGs）及硫酸角蛋白PGs。其中CSPGs大部分定位在细胞外基质中，而HSPGs常为膜性蛋白聚糖。HSPGs可以和许多配体发生直接作用，包括一些生长因子和成形素，如Wnts、BMPs、VEGFs等，以及相应的受体。HSPGs还可与细胞外结构及黏附性分子，如胶原蛋白、纤维蛋白及层黏连蛋白等发生作用。GPCs还可通过成对碱性氨基酸蛋白酶剪切位点的剪切，或GPI锚定作用的去除，进入到细胞外基质中，并发挥作用。GPC3就是一种膜性硫酸肝素蛋白聚糖，包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素链 （HS）和糖基化磷脂酰肌醇（GPI），GPC蛋白通过GPI锚定于细胞外膜上。GPC3在哺乳动物的胚胎期，可通过影响多个信号通路而对组织器官的发生和生长发挥重要调控作用，目前的研究主要集中在基因与肝细胞癌的相关性[3]。

为明确GPC3在颅骨发育调控中的作用，以及突变后发生颅缝早闭症的机制，本实验以SD大鼠为模型，研究GPC3基因在颅缝组织和细胞中不同时期的表达情况，为后续的疾病模型研究提供参照。

1　材料与方法

1.1实验动物及材料

出生1 d、3 d和7 d的SD大鼠，低糖DMEM （Hyclone，美国），胎牛血清（Biowest，法国），Ⅳ型胶原蛋白酶（SERVA，德国），胰蛋白酶-EDTA、Trizol液（Invitrogen，美国），M-MLV反转录酶及相关试剂（Promega，美国），大鼠 GPC3抗体（abcam，英国），EDTA（pH8.0）抗原修复液（武汉谷歌生物公司），氯仿，异丙醇等。

1.2主要仪器及设备

倒置相差显微镜（Leica公司，德国），光学显微镜（Olympus，日本），PCR仪（Eppendorf，德国），高速离心机 （Eppendorf，德国），凝胶成像分析仪（Syngene，英国），倒置荧光显微镜（NIKON ECLIPSE TISR，日本），成像系统（NIKON DS-U，日本）。

1.3方法

1.3.1免疫荧光

分别取出生1 d、3 d和7 d的SD大鼠，处死后置于75%乙醇溶液中浸泡10 min，无菌条件下切取颅盖骨，剥离硬脑膜，取颅骨矢状缝及冠状缝周围1.5 mm组织，尽量去除骨性组织后，加入4%多聚甲醛固定，脱水、透蜡、包埋、切片、脱蜡，制作石蜡切片。切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（pH 8.0）的修复盒中，于微波炉内进行抗原修复。切片稍甩干后用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min。轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加一抗，湿盒内4℃孵育过夜。PBS洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后，滴加二抗覆盖组织，避光室温孵育50 min。PBS洗涤3次，每次5 min。甩干，滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min。PBS洗涤3次，每次5 min。甩干后用抗荧光淬灭，封片剂封片。倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

1.3.2原代细胞获取及培养

以上述相同方法，取颅骨矢状缝及冠状缝周围1.5 mm组织，尽量去除骨性组织后剪碎，放入约10倍体积的0.2%Ⅳ型胶原蛋白酶中，37℃，5 h；100目滤网过滤，获得细胞悬液，1 500 r/min离心3 min，弃上清液。10 mL完全培养液（DMEM+10FBS+ 1%双抗）重悬细胞，转移至培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养。每3天换液一次，1周后胰蛋白酶消化，按1×104cells/cm2传代接种。

1.3.3RT-qPCR

取传种后第1代细胞，使用Trizol裂解，实验操作参照Invitrogen Trizol使用说明，用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。将所得RNA逆转录形成cDNA模板，使用qPCR法定量分析，每个反应重复3次（表1）。

表1　引物序列Table 1　Primer Sequence

1.3.4Western-Blot

取部分原代细胞1 500 r/min离心后去上清液，加入细胞裂解液，4℃、12 000 g离心3 min，留取上清液后用Lowry法定量蛋白，完成电泳后，依次加入封闭液、抗rat GPC3抗体、二抗稀释液，然后用化学发光剂反应后显影定影。

1.4统计学分析

数据采用Graphpad Prism6软件行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1GPC3在不同年龄SD大鼠颅缝组织中的表达结果显示，在1 d、3 d、7 d的颅缝组织中，胞内、

细胞表面及胞外均有GPC3表达，GPC3荧光的表达强度随着大鼠年龄的增加逐步减弱（图1）。2.2GPC3基因表达程度随SD大鼠年龄的变化

图1　不同年龄SD大鼠中GPC3的免疫荧光检测（40×）Fig.1　Immunofluorescence of GPC3 in SD rat of different age (40×)

RT-qPCR结果显示，随着SD大鼠年龄增大，即随着颅缝逐渐闭合，颅缝组织细胞中GPC3基因的表达水平明显降低，其中1 d的SD大鼠颅缝细胞的GPC3基因表达量与3 d的SD大鼠细胞存在统计学差异 （P<0.05），3 d与7 d的SD大鼠细胞存在明显差异（P<0.01）（图2）。

图2　RT-qPCR检测不同年龄SD大鼠颅缝细胞GPC3的相对基因表达量Fig.2　The relative mRNA amount of GPC3 in SD rat of different age detected by RT-qPCR

Western Blot结果显示，随着SD大鼠年龄增大，即随着颅缝逐渐闭合，GPC3在颅缝细胞中的表达量逐渐降低，其中3 d与7 d的SD大鼠的颅缝细胞存在统计学差异（P<0.05），但1 d与3 d的SD大鼠的颅缝细胞无统计学差异（图3）。

图3　Western Blot检测不同年龄SD大鼠GPC3的表达Fig.3　The expression of GPC3 in SD rat of different age detected by Western Blot

3　讨论

本研究中，我们首先应用免疫荧光技术来确定GPC3基因在大鼠颅缝组织中的表达位置。通过荧光图像发现，GPC3基因在1 d、3 d、7 d的SD大鼠颅缝组织中均有表达，且在胞内、细胞表面及细胞外基质中均检测到GPC3，说明GPC3的生理作用可能不仅限于锚定在细胞表面，解锚定后，GPC3进入细胞外基质中可能也会发挥相应的作用，具体机制仍有待探索。

我们应用RT-qPCR和Western Blot技术分别从转录水平和蛋白水平，来确定GPC3随着SD大鼠年龄增加的表达情况。RT-qPCR结果显示，随着SD大鼠年龄增加，GPC3基因的表达量明显下降，且第3天到第7天的下降程度明显较第1天到第3天的程度大，这与SD大鼠的颅缝闭合趋势是相符合的。Western Blot的结果也从蛋白水平上基本验证了这个结果。因此，我们判断，GPC3基因的表达与颅缝闭合存在非常紧密的联系，该基因在颅缝成骨的过程中可能扮演了非常重要的角色。

GPCs（磷脂酰肌醇蛋白聚糖类）为HSPGs家族成员之一，是一种生长因子通路的调节因子，一般通过糖基化磷酯酰肌醇锚定于细胞膜。解开锚定，脱离细胞膜后，即成为游离态的GPCs，同样也会产生一定的生理功能。其在细胞的主要信号通路，如BMP信号通路、FGF信号通路、HH信号通路以及WNT信号通路中，都有其特定的效应。因此，该类蛋白在生长发育和稳态调节中均有重要的作用[4]。

Pilla等[5]报道了GPC3基因突变所导致的X连锁遗传病：过度生长和畸变综合征（SGBS）。Cano-Gauci等[6]发现，敲除小鼠GPC3基因的第一个外显子后，其体内无法检测到GPC3基因的mRNA的表达，并出现典型的SGBS的临床表现，包括围产期死亡、过度生长发育、多囊肾、肾发育不全及肺部异常发育等。

GPC3在细胞信号转导过程中有着重要的作用，目前的研究对于其与BMP信号通路的关系研究比较明确。骨形成蛋白（BMPs）是促进骨形成的重要蛋白。BMPs信号通道中的效应器转录因子MSX2，发生基因突变可导致Boston-type颅缝早闭。兔动物模型研究显示，高浓度的BMP2可导致颅缝过早闭合[7]。因此，BMPs及其信号通道是明确颅缝早闭发病机制的重要研究方向之一。文献提示，GPC3参与调节骨形成蛋白（BMPs）及其信号通道。Dwivedi等[8]发现，GPC3在颅缝区表达，而在颅缝过早闭合的患儿颅缝区表达是下降的。此外，GPC1和GPC3同时表达于颅缝细胞表面并释放入细胞外基质。同时表达的GPC1与GPC3可抑制BMP2、BMP4和BMP7的活性，消除GPC1和GPC3活性可增强BMP2活性。相反，使GPC1和GPC3过表达或者在培养体系中添加GPC1或GPC3，可阻止BMP2信号通道及BMP2调节的成骨分化。该结果表明，GPC3对BMPs信号通道具有负向调节作用。而Dejima等[9]的研究则表明，GPCs对BMPs信号通道具有正向调节作用。无论是体内还是体外实验均显示，果蝇的GPCs可增强BMPs信号通道。这两种矛盾的结果可能是由于物种的不同所导致的，但都表明了GPCs参与BMPs信号通道的调节。另外，通过对GPC3基因敲除小鼠的研究发现，GPC3与BMP4在骨发育中具有相互作用[10]，与BMP2、BMP7在肾形态发育中具有相互作用类似[11-12]。关于GPC3在FGF、WNT信号通路中的作用，目前仅有少量研究。Midorikawa等[13]发现，GPC3在肝癌细胞中，与FGF2相互作用，并抑制FGF信号通路；Lai等[14]发现，GPC3在肝癌细胞中增强经典WNT信号通路并促进肝癌细胞生长。但是，对于小鼠乳腺腺癌细胞的研究发现，GPC3抑制经典WNT信号通路，增强非经典WNT信号通路[15]。因此，GPC3在FGF信号通路和WNT信号通路中的作用机制仍然需要进一步的探索研究。

本实验初步阐明了GPC3基因在SD大鼠颅缝发育过程中的表达趋势，结合Coussens等的研究结果，我们推断，GPC3的低表达可能与颅缝早闭的发生与发展存在密切的联系，对于其在颅缝早闭症中的具体作用与机制仍然需要进一步的实验探索。

参考文献

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【中图分类号】R622

【文献标识码】A

【文章编号】1673－0364（2016）03－0163－04

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.005

作者单位：200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

通讯作者：曹德君（E-mail：dejuncao@163.com）。

收稿日期：（2016年4月15日；修回日期：2016年6月8日）

Expression of GPC3 in Cranial Suture Cells of Different Stages of Rats

ZHANG Ce,Shim Yoong-hoon,CAO Dejun. Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:CAO Dejun(E-mail:dejuncao@163.com).

【Abstract】ObjectiveTo explore GPC3 expression in cranial suture tissues and cells of different stages,and to provide reference for later research in disease models.MethodsThe cranial suture tissues and cells of 1 d,3 d,7 d SD rats were observed.The expression level of GPC3 were analyzed by immune-histofluorescence staining,RT-qPCR and Western Blot to judge the relationship between GPC3 expression and calvarial osteogenesis/fusion of cranial sutures.ResultsGPC3 was expressed in all stages of unfused rat cranial suture tissues by immune-histofluorescence staining.Results of RT-qPCR and Western Blot showed a descending trend of GPC3 expression with the age increasing.ConclusionIn SD rats,GPC3 has a close relationship with fusion of cranial sutures.

【Key words】Cranial suture cells;SD rats;GPC3