SIRT1对卵巢癌CAOV3细胞增殖的影响及可能机制

刘恒，叶丽平

(1.锦州医科大学 基础医学院，辽宁 锦州 121001；2.辽河油田总医院渤海院区 肿瘤诊治中心，辽宁 盘锦 124010)

SIRT1对卵巢癌CAOV3细胞增殖的影响及可能机制

刘恒1,2，叶丽平1Δ

(1.锦州医科大学 基础医学院，辽宁 锦州 121001；2.辽河油田总医院渤海院区 肿瘤诊治中心，辽宁 盘锦 124010)

目的 分析沉默信息调节因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)对人卵巢癌CAOV3细胞增殖的影响，并探讨可能的作用机制。方法 利用Lipofectamine 2000转染体外培养的卵巢癌CAOV3细胞，分为正常对照组、阴性对照组和SIRT1-siRNA转染组。RT-PCR和Western blot检测SIRT1的mRNA和蛋白表达水平；MTT检测RNA干扰SIRT1后24、48、72h CAOV3细胞增殖情况；流式细胞术检测RNA干扰SIRT1后CAOV3细胞周期分布；Western blot检测RNA干扰SIRT1后CAOV3细胞SIRT1、p53、p21蛋白表达水平和p53乙酰化状态；免疫共沉淀检测SIRT1蛋白和p53蛋白的相互作用。结果 与阴性对照组相比，SIRT1-siRNA转染组72 h后SIRT1的mRNA和蛋白表达水平减少(P<0.05)；SIRT1-siRNA转染组48、72 h后的细胞增殖率明显降低(P<0.01)；SIRT1-siRNA转染组S期细胞在细胞周期中所占比例显著减少(P<0.01)，G1期细胞则明显增加(P<0.01)；SIRT1-siRNA转染组p53和p21蛋白表达水平显著升高，p53处于高乙酰化状态(P<0.01)；在卵巢癌CAOV3细胞中SIRT1蛋白与p53蛋白存在相互作用。结论 通过特异性干涉SIRT1的表达能够抑制卵巢癌CAOV3细胞的增殖，其机制可能为RNA干扰下调SIRT1的表达后，p53蛋白处于高乙酰化状态，继而增强了p53蛋白依赖的p21蛋白的转录激活，从而阻滞细胞周期，抑制细胞增殖。

SIRT1；RNA干扰；卵巢癌；CAOV3；p53；p21

沉默信息调节因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1)是在哺乳动物细胞中发现的，属于sirtuin家族，为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性的组蛋白去乙酰化酶[1]。SIRT1 参与体内多种重要的生理病理过程，在急性髓细胞白血病、前列腺癌、骨癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤中，内源性SIRT1的表达明显高于正常组织，SIRT1在肿瘤发生过程中可能起到癌基因的作用[2-4]。另一方面，SIRT1在胃癌、恶性胶质瘤、膀胱癌中表达下调，提示SIRT1可能起到抑癌基因的作用[5-6]。因此，SIRT1在各种肿瘤组织中呈现异质性表达，通过多种调控机制发挥作用。例如SIRT1与Wnt和Notch等多种信号通路中的NF-κB、c-Myc、p53等蛋白存在相互作用，共同参与细胞周期的调控、参与炎症反应、抑制细胞凋亡等，进而发挥对基因的调控作用[7-8]。SIRT1在卵巢癌的发生发展进程中扮演什么样的角色并不明确。

有研究表明SIRT1在恶性卵巢癌组织中的表达水平明显高于良性肿瘤组织[9]，但SIRT1在卵巢癌细胞中的作用还未见报道。SIRT1在卵巢癌的组织和细胞水平上表型是否一致？本研究旨在通过在卵巢癌CAOV3细胞株中特异性干涉SIRT1的表达，探讨下调SIRT1表达对人卵巢癌CAOV3细胞增殖的影响，通过检测SIRT1蛋白和p53蛋白之间是否存在相互作用，研究SIRT1在卵巢癌CAOV3细胞中的作用机制，为RNA干扰治疗卵巢癌提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人卵巢癌细胞株CAOV3购于齐氏生物科技有限公司。

1.1.2 试剂：Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；SIRT1 siRNA(上海吉玛公司)；DMEM/F12培养液(Hyclone公司)；SIRT1和p53抗体(Santa cruz公司)；p21抗体和Ac-p53 (lys382) 抗体(Cell signal公司)；GAPDH抗体、HRP标记的山羊抗兔，抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Protein A Sepharose TM CL-4B(AB公司)；MTT、BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL化学发光试剂盒(北京碧云天生物技术公司)。

1.1.3 仪器：CO2培养箱(Thermo公司)；PCR扩增仪(Mastercycler nexus X2，Eppendorf公司)；流式细胞仪(XL/XL-MCL,贝克曼库尔特有限公司)；水浴式电转印槽、电泳仪(Bio-Rad，美国)；IBOX-600全自动凝胶成像系统(UVP，美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：CAOV3细胞培养条件为DMEM/F12培养基、10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素、饱和湿度、37 ℃和5%CO2。

1.2.2 SIRT1 siRNA的合成和转染：针对人SIRT1的mRNA序列(GenBank No.NM_012238)设计特异的SIRT1 siRNA序列：正义链5’-GAAGUUGACCUCCUCAUUGUdTdT-3’，反义链 5’-ACAAUGAGGAGGUCAACUUCdTdT-3’[10]，阴性对照序列：正义链5’-CUUACGCUGAGUACUUUCGA-3’，反义链 5’-UCGAAAGUAC-UCAGCGUAAG-3’由上海吉玛公司纯化合成。卵巢癌CAOV3细胞接种于6孔细胞培养板中，分为正常对照组、阴性对照组和SIRT1-siRNA转染组，Lipofectamine 2000转染，按照说明书进行。

1.2.3 RT-PCR方法检测SIRT1的mRNA表达水平:利用Trizol提取各组CAOV3细胞总RNA，并测定RNA浓度。按实验室常规方法进行逆转录和PCR。SIRT1引物为F：5’-TGGCACA-GATCCTCGAACAA-3’和R：5’-TTTGGATTCCC-GCAACCTGT-3’，预期片段长度为491bp；GAPDH引物为F：5’-CGGAGTCA-ACGGATTTGGTCGTAT-3’，5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，预期片段长度为306 bp。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；30个循环；72 ℃终延伸7 min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并拍照。Image J软件进行灰度值分析。基因mRNA表达水平以每一样品与其内参GAPDH灰度比值表示，实验重复3次。

1.2.4 MTT法检测CAOV3细胞生长增殖:将各组转染CAOV3细胞消化离心，以5×103个/孔接种于96孔培养板，完全培养基总量为200 μL。每组细胞设6个复孔，检测时间点为24、48、72 h；每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h；各孔加入150 μL DMSO，摇床上低速慢摇15 min；酶标仪上A490nm处测定每孔的A值；根据A值的大小来计算增殖率。公式如下：细胞增殖率=实验组A值/阴性对照组A值×100%。实验重复6次。

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期:将处于对数生长期的CAOV3细胞接种于6孔培养板中，24 h后细胞数达到孔底面积80%时进行转染。细胞转染72 h后用胰蛋白酶消化，收集细胞，离心5 min，加1 mL 4 ℃预冷的70%冷乙醇固定，4 ℃过夜。离心，加入250 μg/mL的RNase A，4 ℃孵育30 min，向细胞悬液中加入50 μL PI，4 ℃避光孵育30 min；流式细胞仪检测分析。实验重复3次。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达:取各组细胞，加蛋白裂解液，提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度。加入5×SDS样品缓冲液，100 ℃煮沸5 min，离心后上样，10%SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS(pH 7.4)封闭滤膜2 h，再分别与anti-SIRT1抗体(稀释比为1:500)、anti-Ac-p53 (lys382)抗体(稀释比为1:500)、anti-p53抗体(稀释比为1:500)、anti-p21抗体(稀释比为1:1000)和anti-GAPDH(稀释比为1:1000)，4 ℃温育过夜。TTBS洗涤3次后，HRP偶联的IgG(稀释比为1:5000)室温温育2 h，摇床上10 min洗膜3次，ECL发光法显色。实验重复3次。

1.2.7 免疫共沉淀检测SIRT1和p53之间相互作用:CAOV3细胞培养48 h后，5×含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞。将细胞12，000 g离心25 min；取上清定量蛋白，取等量蛋白沉淀；在EP管中加入20 μL裂解液和5 μL 5×SDS上样缓冲液，煮沸，-20 ℃保存留作上样。取20 μL预冷混悬的蛋白A/G琼脂糖珠子和2 μL与免疫沉淀时使用的抗体同种属的普通IgG(normal IgG)，加入细胞上清液中，离心30 min。取上清，分出50 μL留存，补足体积至0.5 mL，加入4 μL p53抗体，孵育3 h后加入50 μL蛋白A/G琼脂糖珠子继续孵育2 h；离心弃上清；剩余的琼脂糖珠子用PBS清洗，离心3 min。如上，反复洗5次，以上操作均在4 ℃条件下进行。最后一次离心之后，加20 μL 2×SDS上样缓冲液，煮沸5 min，蛋白变性后，离心，取上清液准备进行电泳。SDS-PAGE电泳和转膜同上，SIRT1一抗孵育过夜，洗膜3次后，二抗孵育2 h，洗膜后，ECL发光检测蛋白表达，实验重复2次。

2 结果

2.1 RNA干扰对SIRT1 mRNA和蛋白水平的影响 与正常对照组相比，实验组SIRT1 mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.01)，而阴性对照组无明显区别，见图1、表1。

图1 CAOV3细胞转染SIRT1 siRNA后SIRT1的mRNA(A)和蛋白(B)表达水平1：正常对照组；2：阴性对照组；3：SIRT1-siRNA组Fig.1 Expression levels of SIRT1 mRNA(A) and protein(B) in CAOV3 cells transfected with siRNA SIRT11:Normal control group 2：Negative control group 3：SIRT1-siRNA transfected group

组别SIRT1/GAPDHmRNASIRT1/GAPDHprotein正常对照组0.49±0.070.67±0.15阴性对照组0.45±0.090.62±0.11SIRT1siRNA组0.23±0.09*0.28±0.10*

*P<0.01，与阴性对照组相比，compared with negative control group

2.2 SIRT1干扰对CAOV3细胞增殖的影响 转染SIRT1 siRNA 24 h后CAOV3细胞增殖率为(94.65±5.8)%，转染SIRT1 siRNA 48 h后CAOV3细胞增殖率为(75.72±7.9)%，而转染SIRT1 siRNA 72 h后细胞增殖率为(64.62±11.1)%。细胞增殖率明显降低(P<0.01)，见图2。

图2 转染SIRT1 siRNA后不同时间点CAOV3细胞增殖率Fig.2 Cell proliferation rate of CAOV3 cells at different time points after transfection with SIRT1-siRNA ±s,n=6)

2.3 SIRT1-siRNA对CAOV3细胞周期的影响 与阴性对照组相比，转染SIRT1-siRNA的CAOV3细胞株中G1期细胞增加，S期细胞减少(P<0.01)，见表2。

表2 转染SIRT1-siRNA对CAOV3细胞周期的影响

*P<0.01，与阴性对照组比较，compared with negative control group

2.4 SIRT1-siRNA对细胞周期相关蛋白的影响 Western blot结果显示：与对照组比较，SIRT1-siRNA组p53、p21蛋白的表达水平显著增加(P<0.01)，p53处于高乙酰化状态，见图3、表3。

图3 Western blot检测CAOV3细胞中相关蛋白表达1：正常对照组；2：阴性对照组；3：SIRT1-siRNA组Fig.3 Expression of related proteins in CAOV3 cells by Western blot1:Normal control group;2:Negative control group;3:SIRT1-siRNA transfected group

组别p53/GAPDHproteinAc-p53/GAPDHproteinp21/GAPDHprotein正常对照组0.51±0.120.32±0.100.36±0.09阴性对照组0.49±0.090.30±0.080.33±0.08SIRT1-siRNA组0.69±0.14*0.47±0.08*0.49±0.09*

*P<0.01，与阴性对照组比较，compared with negative control group

2.5 SIRT1和p53的相互作用研究 经p53抗体孵育后，120 kDa位置上检测到SIRT1的表达条带，Input组也检测到相应的条带，表达量比IP组高，但阴性对照IgG组没有检测到条带。表明IRT1和p53之间存在相互作用。见图4。

图4 免疫共沉淀检测SIRT1与p53的相互作用Fig.4 Immunoprecipitation results of SIRT1 and p53

3 讨论

SIRT1属于Ⅲ类去乙酰化酶家族中的一员，可以去乙酰化众多的蛋白质，参与生物体内各种各样的生物学过程。近年来，关于SIRT1在肿瘤中的作用，由于实验室条件和细胞系的差异，结果千差万别[11]。卵巢癌的发生发展是一个非常复杂的病理过程，涉及多种生物学和遗传学因素，有研究表明SIRT1在这一过程中起着重要作用[12]，但SIRT1在卵巢癌中的具体机制如何尚不明确。

本研究利用RNA干扰技术，转染针对人SIRT1特异靶序列的siRNA，探讨下调SIRT1的表达对CAOV3细胞增殖的影响及其可能机制。RT-PCR和Western-blot结果显示RNA干扰SIRT1 可明显降低内源性SIRT1的mRNA和蛋白表达水平，说明SIRT1-siRNA可明显下调SIRT1的表达，有一定的特异性。MTT结果表明，转染SIRT1 siRNA 48h和72 h后细胞增殖率明显下降，说明干扰SIRT1能抑制细胞生长。流式细胞结果表明，SIRT1-siRNA干扰组G1期细胞明显增加，表明细胞周期被阻滞在G1期，间接表明干扰SIRT1可抑制CAOV3细胞增殖。

有研究表明，在细胞氧化应激状态和发生DNA损伤时，SIRT1的表达增加可抑制由p53蛋白介导的细胞凋亡和细胞周期阻滞[13]；采用特异性抑制剂抑制SIRT1蛋白的表达，使p53蛋白处于高乙酰化状态，增强了p53蛋白依赖的转录激活作用，增加了细胞对应激状态的敏感性[14]。但在卵巢癌CAOV3细胞中SIRT1和p53的关系尚不清楚。本实验采用SIRT1 siRNA转染CAOV3细胞，p53蛋白表达水平明显升高，说明p53蛋白的激活调控发生在翻译后修饰水平，与Sun 等[15]结果一致。同时应用乙酰化p53(lys382)抗体和p21抗体检测下调SIRT1表达后p53的乙酰化状态和p21蛋白的表达水平，结果表明SIRT1被干涉后p53处于高乙酰化状态，p21蛋白表达水平显著上调，说明抑制SIRT1的表达后，p53被快速乙酰化，进而增强了p53依赖的转录激活，尤其是p21蛋白的转录激活。应用免疫共沉淀方法表明CAOV3细胞中SIRT1和p53蛋白存在相互作用。

综上所述，本研究结果表明下调SIRT1的表达可抑制卵巢癌CAOV3细胞的增殖，阻滞细胞周期进程，且SIRT1和p53存在相互作用，说明SIRT1特异结合p53并使其去乙酰化，导致p53介导的转录激活的负调控，特别是p53介导的p21转录激活。这些结果提示了SIRT1可能在卵巢癌的发生发展中起到癌基因的作用，其作用机制可能与调控p53/p21通路相关。

[1] Blander G,Guarente L.The Sir2 family of protein deacetylases[J].Annu Rev Biochem,2004,73(2):417-435.

[2] Kim MJ,Hong KS,Kim HB,et al.Ku70 acetylation and modulation of c-Myc/ATF4/CHOP signaling axis by SIRT1 inhibition lead to sensitization of HepG2 cells to TRAIL through induction of DR5 and down-regulation of c-FLIP[J].Int J Biochem Cell Biol,2013,45(3):711-723.

[3] Mvunta DH,Miyamoto T,Asaka R,et al.Overexpression of SIRT1 is Associated With Poor Outcomes in Patients With Ovarian Carcinoma[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2016 Feb 9.[Epub ahead of print]

[4] Zhang C,Qu S,Wei X,et al.HSP25 down-regulation enhanced p53 acetylation by dissociation of SIRT1 from p53 in doxorubicin-induced H9c2 cell apoptosis[J].Cell Stress Chaperones,2016,21(2):251-260.

[5] Feng Y,Liu T,Dong SY,et al.Rotenone affects p53 transcriptional activity and apoptosis via targeting SIRT1 and H3K9 acetylation in SH-SY5Y cells[J].J Neurochem,2015,134(4):668-676.

[6] Anastasiou D,Krek W.SIRT1:linking adaptive cellular responses to aging-associated changes in organismal physiology[J].Physiology (Bethesda),2006,21:404-410.

[7] Nemoto S,Fergusson MM,Finkel T.SIRT1 functionally interacts with the metabolic regulator and transcriptional coactivator PGC-1{alpha}[J].J Biol Chem,2005,280(16):16456-16460.

[8] Rodgers JT,Lerin C,Haas W,et al.Nutrient control of glucose homeostasis through a complex of PGC-1alpha and SIRT1[J].Nature,2005,434(7029):113-118.

[9] Bordone L,Motta MC,Picard F,et al.Sirt1 regulates insulin secretion by repressing UCP2 in pancreatic beta cells[J].PLoS Biol,2006,4(2):e31.

[10] Chen D,Steele AD,Lindquist S,et al.Increase in activity during calorie restriction requires Sirt1[J].Science,2005,310(5754):1641.

[11] Yuan Z,Zhang X,Sengupta N,et al.SIRT1 regulates the function of the Nijmegen breakage syndrome protein[J].Mol Cell,2007,27(1):149-162.

[12] Wang RH,Sengupta K,Li C,et al.Impaired DNA damage response,genome instability,and tumorigenesis in SIRT1 mutant mice[J].Cancer Cell,2008,14(4):312-323.

[13] Pfluger PT,Herranz D,Velasco-Miguel S,et al.Sirt1 protects against high-fat diet-induced metabolic damage[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(28):9793-9798.

[14] Banks AS,Kon N,Knight C,et al.Sirt1 gain of function increases energy efficiency and prevents diabetes in mice[J].Cell Metab,2008,8(4):333-341.

[15] Sun C,Zhang F,Ge X,et al.SIRT1 improves insulin sensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTP1B[J].Cell Metab,2007,6(4):307-319.

(编校：吴茜)

Effect of SIRT1 on the proliferation of ovarian cancer CAOV3 cells and its possible mechanism

LIU Heng1,2, YE Li-ping1Δ

(1.Department of Pathophysiology, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China; 2.Liaohe Oil Field General Hospital, Panjin 124010, China)

ObjectiveTo observe the effect of SIRT1 on the proliferation of ovarian cancer CAOV3 cells and its possible mechanism.MethodsOvarian cancer CAOV3 cells were transfected the Lipofectamine 2000 and were divided into normal control group，negative control group and SIRT1-siRNA group.The mRNA and protein expression levels of SIRT1 were detected by RT-PCR and Western blot.MTT method was used to detect the proliferation of RNA interference at 24h，48h and 72h，respectively.The distribution of CAOV3 cell cycle phase after RNA interference of SIRT1 for 72 hours was detected by flow cytometry.SIRT1，p53，p21 protein expression and p53 acetylation status were detected by Western blot with RNA interference of SIRT1 after 72 hours.The interaction between SIRT1 and p53 protein was verified by immunoprecipitation in CAOV3 cells.ResultsCompared with negative control group，the expression of mRNA and protein of SIRT1 in SIRT1-siRNA group decreased after transfection of SIRT1 for 72 hours.The survival rate of CAOV3 cells in SIRT1-siRNA group decreased significantly at 48 hours and 72 hours (P<0.01).The proportion of Sphase cells in CAOV3 cells transfected with SIRT1-siRNA for 72h was significantly decreased (P<0.01)，while the G1phase cells were significantly increased (P<0.01)，and the cells arrested in the G1phase.The expression of p53 and p21 proteins were significantly increased and the p53 was in higher acetylation status after transfection with SIRT1-siRNA for 72 hours (P<0.01).SIRT1 was interacted with p53 protein in CAOV3 cells confirmed by co-immunoprecipitation.ConclusionDownregulation of SIRT1 expression can inhibit the proliferation of ovarian cancer CAOV3 cells，which maybe connected with p53 at high acetylation status，and enhancing p53-dependent p21 transcriptional activation，thus blocking the cell cycle and inhibiting the cell proliferation.

SIRT1; siRNA; ovarian cancer; CAOV3; p53; p21

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.13

刘恒，女，硕士在读，主治医师，研究方向：肿瘤细胞信号转导，E-mail: 59588673@qq.com。叶丽平，通信作者,女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：细胞信号转导，E-mail: 43120890@qq.com

R581.3

A