高效降解棉酚菌株的筛选及脱毒条件的研究

侯敏，包慧芳，王宁，詹发强，杨蓉，龙宣杞，崔卫东

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐　830091)



高效降解棉酚菌株的筛选及脱毒条件的研究

侯敏，包慧芳，王宁，詹发强，杨蓉，龙宣杞，崔卫东

(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，乌鲁木齐830091)

摘要：【目的】选育降解棉酚菌株，组建复合菌系，优化固体发酵条件。【方法】从实验室已有菌株、动物新鲜粪便和土壤中筛选降解棉酚菌株，确定共生菌株混合配比，采用响应面法评价水分、接种量、发酵天数及其交互作用对棉酚降解率的影响，在此基础上，对主要影响因素进行回归分析。【结果】选育出10株符合《饲料添加剂品种目录(2013)》中规定的降解棉酚菌株，确定共生菌株最优配比为QC-3∶QC-5∶QC-9∶QC-10按1∶2∶1∶1，最优的固体发酵培养条件为水分68.8%、接种量12.8%、发酵天数42.5 d，在此条件下脱毒率可达到91.4%。【结论】确定了混合菌发酵棉秸秆脱毒的最佳条件，为混合菌棉秸秆固体发酵降低游离棉酚含量的研究提供了相应的工艺参数和理论依据。

关键词：棉秆；棉酚；脱毒；固体发酵

0引 言

【研究意义】新疆是我国重要的棉花生产基地，棉花种植面积约 133. 3 ×104hm2(2 000 万亩)，据统计新疆棉秸秆总产量 2013 年超过 800×104t。从2012年起，新疆启动《新疆新增1 000万只出栏肉羊综合生产能力建设规划 (2012～2015年)》，提出的北疆围绕畜牧业、南疆围绕林果业，调优种植结构的要求，着力加强饲草料生产保障体系建设。魏敏等[1]测定出新疆奎屯棉花秸秆中粗蛋白6.5%，比玉米秸秆、稻草和小麦秸秆的粗蛋白含量都要高。棉酚是锦葵科棉属植物色素腺产生的多酚二萘衍生物俗称棉毒素，是棉花秸秆作为饲料的限制因素。存在形式有两种，即结合棉酚 (boundgossypol) 和游离棉酚 (freegossypol)。含有一定量的游离棉酚(freegossypol)，可以导致动物生长受阻、生产力下降、贫血、呼吸困难、繁殖力下降、甚至不育，严重时可致死亡[2]。所以，降解棉酚含量、提高其营养及适口性，是棉秆成为动物饲料的当务之急。【前人研究进展】生物发酵法被普遍认为是当前最安全、脱毒效果好、生产成本低、最有发展前途的脱毒方法[3]。采用微生物发酵将棉酚转化为其他物质，达到脱毒目的，同时又可提高粗饲料的营养价值，增加适口性和采食量[4]。棉酚生物降解的研究历史由来已久。Reiser[5]发现反刍动物瘤胃中的微生物和酶作用于棉酚，其被破坏并随纤维素而水解转入真胃中，相对解决了棉酚的毒性问题；此外还发现在霉变的棉籽饼中棉酚含量也非常低，说明其中所生长的某类霉菌对游离棉酚可能存在降解作用[6]。目前，国内所筛选的降解棉酚菌种主要是黑曲霉[7]和产阮假丝酵母[8-9]两类。【本研究切入点】近年来，运用微生物发酵处理棉秆，主要应用于生物肥料，大部分实验菌株不符合农业部对饲料微生物添加剂的规定。【拟解决的关键问题】筛选较高降解棉酚能力且适用于饲料发酵的益生菌株，并采用响应曲面法进行固体发酵工艺条件的研究，达到最好的脱毒效果及提高棉秆营养价值。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1醋酸棉酚

醋酸棉酚：购自上海生物工程有限公司，纯度99%。

1.1.2样 品

实验室已有菌株；五家渠棉花种植地土壤；吐鲁番鄯善县鲁克沁镇牧场牛、羊、骆驼新鲜粪便。

1.1.3培养基

MRS培养基、YPD培养基、LB培养基、NA培养基见《微生物学实验技术》[10]。以醋酸棉酚为唯一碳源的培养基：醋酸棉酚5.0 g，(NH4)2SO22.0 g，MgSO·7H2O 0.2 g，NaH2PO4·H2O 0.5 g，CaCl2·H2O 0.1 g，K2HPO40.5 g。琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4。固态发酵培养基：五家渠农户粉碎棉秸秆。

1.2方 法

1.2.1初筛棉酚降解菌株

取1 g新鲜土样(牛、羊、骆驼新鲜粪便)于9 mL无菌水中，经过梯度稀释，涂布于初筛培养基平板上，35℃恒温倒置培养48 h，挑取分离得到的形态不同的单菌落，分别转接到以醋酸棉酚为唯一碳源的平板培养基上，然后倒置于35℃培养箱中培养48 h。挑选能够生长的菌株转接至NA培养基斜面上，35℃恒温培养24 h，置于4℃冰箱保存。

将实验室现有菌株分别在棉酚浓度为100、200 、300 、400 、500 和1 000 mg/kg的NA培养基平板中35℃培养48 h，观察菌株的生长状况，挑选耐受棉酚菌株。

1.2.2复筛棉酚降解菌株

将初筛耐受棉酚的菌种制备成活菌数为1010～1011CFU的菌悬液，固体培养基棉秸秆处理为1～2 cm长度，加水量60%，接菌量5%，混匀，装入1 L的太空杯中。对照组加入5%的无菌生理盐水替代菌悬液。置于室温发酵30 d后，自然晾干，粉碎，过40目筛，测定发酵前后的棉酚含量，根据棉酚降解率，选择优良菌株。

1.2.3菌株间拮抗实验

将筛选得到的菌株在牛肉膏蛋白胨培养基平板上两两交叉划线，倒置放于35°C的培养箱中培养3 d，观察交叉点菌株生长情况。交叉点菌株不生长的为菌株之间有拮抗作用，实验选用不产生拮抗作用的菌株并进行合理组合。

1.2.4棉酚降解菌株分子生物学鉴定

采用美国ZR Fungal/Bacterial DNA KitTM试剂盒提取菌株基因组。利用通用引物扩增细菌16s rDNA或真菌18s rDNA。PCR扩增反应体系为50 μL，含有24 μL premixTaq，引物各1 μL，模板2 μL，无菌水22 μL。16s rDNA扩增条件：94℃ 4 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min；18s rDNA扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 60 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min。扩增产物经l%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，测序由上海生物工程有限公司完成。将测序得到的序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的序列，用ClustalX 软件和 MEGA 6.0 中的Neighbor-joining 法构建系统进化树。根据我国农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》中规定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种，筛选出适用于饲料发酵的降解株菌。

1.2.5确定混菌配比

挑选4株共生菌，分别准备种子培养液，设计不同混合配比进行固体发酵实验。在室温下，以5%的接菌量、60%的含水量、发酵30 d。列出混合配比试验设计。表1。

表1混菌混合配比实验设计

Table 1The design of mix strain rate

名称Primername菌株1Strain1菌株2Strain2菌株3Strain3菌株4Strain41111122111312114112151112CK0000

1.2.6棉秸秆固体发酵条件优化

以棉秆为底物，按照试验设计，室温下做发酵瓶装试验。以Y游离棉酚的含量为指标，考察以发酵初始加水量X1、接种量X2、发酵时间X3为试验因素，进行二次回归中心组合试验设计，拟合自变量与响应值之间的函数关系。其中加水量为50%、60%、70%；接种量为5%、10%、15%；发酵时间为30、45、60 d。

1.2.7测定棉酚含量

按国标GB13086-91《饲料中游离棉酚的测定方法》测定。

2结果与分析

2.1棉酚降解菌的分离筛选

采用以醋酸棉酚为唯一碳源培养基，从五家渠棉花种植地土壤、吐鲁番鄯善县鲁克沁镇牧场牛、羊、骆驼新鲜粪便和实验室已有菌株中筛选耐受棉酚菌株25株。挑选长势好的菌株10株，经摇瓶发酵后，以5%的添加量，加入1L棉秆中，进行固体发酵实验。发酵30 d后，检测棉秆中游离棉酚的含量。CK棉秆中的棉酚含量为326 mg/kg，菌株QC-3的棉酚降解率为69.6%，菌株QC-10的棉酚降解率为69%。另外，菌株QC-1的棉酚降解率为59.2%，菌株QC-4的棉酚降解率为52.1%，菌株QC-6的棉酚降解率为64.7%，菌株QC-7的棉酚降解率为64.1%，各个菌株对棉酚都有一定程度的降解。表2

表2　单个菌株对棉秆中棉酚降解

2.2菌株间拮抗实验

将筛选得到的菌株在以醋酸棉酚为唯一碳源的NA培养基平板上两两交叉划线，倒置放于35°C的培养箱中培养3 d，观察交叉点菌株生长情况。结果显示。交叉点处，菌株没有生长或有生长缓慢的现象，说明两菌株间产生拮抗作用；交叉点处，菌株生长良好，说明两菌株间没有产生拮抗作用。QC-3、QC-5、QC-9与QC-10两两之间没有拮抗作用，挑选进行后续实验。图1

2.3分子鉴定及系统发育

棉酚降解菌的基因组 16S rDNA和18S rDNA 的 PCR 扩增产物，所获得的棉酚降解菌 16S rDNA 和18S rDNA 序列经生物公司测序后，与GenBank中相关数据库进行相似性分析，利用MEGA 6.0 中的Neighbor-joining 法构建系统进化树。菌株QC-3与Candidautilis(AF239662) 处于最小分支，是Candidautilis(AF239662) 的近似种；菌株QC-5与BaclicuslincheniformisPFL (AJ577854.1) 处于最小分支，是BaclicuslincheniformisPFL (AJ577854.1) 的近似种；QC-9与LctobacillusplantarumB21 (NZ_CP010528.1) 处于最小分支，是LctobacillusplantarumB21 (NZ_CP010528.1) 的近似种；QC-10与Bacillussp. cp-p (EU584531) 处于最小分支，是Bacillussp. cp-p (EU584531) 的近似种。图2

图1　拮抗性试验结果

图2　菌株系统发育树

2.4最佳混菌配比确定

结合生产实际，将菌株QC-3、QC-5、QC-9与QC-10进行一定比例的混合。室温下，以5%的接菌量、60%的含水量、发酵30 d。对照CK棉酚含量为283.3 mg/kg，当混菌QC-3∶QC-5∶QC-9∶QC-10按1∶1∶1∶1的比例添加时，脱毒率达到76.8%；当混菌按2∶1∶1∶1的比例添加时，脱毒率达到83.9%；当混菌按2∶1∶1∶1的比例添加时，脱毒率达到83.9%；当混菌按1∶1∶2∶1的比例添加时，脱毒率达到84.1%；当混菌按1∶1∶1∶2的比例添加时，脱毒率达到80.2%；当混菌按1∶2∶1∶1的比例添加时，脱毒效果最好，脱毒率达到86.4%。混合菌液体发酵实验结果。表3

2.5棉秸秆固体优化结果

结合生产实际，以脱毒率为响应变量，并以固体发酵的水分、接种量、发酵天数为影响因子，进行3因素3水平的Box-Behnken响应面分析试验。试验设计与结果中可以看出，试验组2，发酵条件为接种量10%、发酵时间45 d、水分60%时，脱毒效果最好，脱毒率为91.1%。表4，表5

采用Design Expert软件对试验数据进行响应面方差分析，得出二次模型回归统计分析表，寻求最佳响应因子水平。对表中数据进行回归分析，得到脱毒率对水分、接种量、发酵天数的二次多项回归方程：脱毒率%=89.82+0.15×A+2.84×B+0.79×C+3.27×A×B-1.38×A×C-2.30×B×C-0.84×A2-5.11×B2-4.71×C2。表6

研究表明，失拟项不显著P>0.05，而模型的P值<0.05，表明模型显著。一次项B，二次项B2、C2对结果影响显著，一次项A、C，交互项AB、AC、BC，二次项A2对结果影响不显著。手动对回归模型进行优化，优化后的回归方程为：脱毒率%=89.47+2.84×B+0.79×C-5.15×B2-4.75×C2。表6

表3　混菌混合配比实验结果

表4　因素水平

表5　Box- Behnken 设计方案及响应值结果

表6　二次响应面回归模型方差分析

失拟项不显著P>0.05，而模型的P<0.01，表明模型高度显著。优化后模型F-value值和模型lack of fit 值变化不大，表明新的拟合方程仍能够满足响应面分析的要求，可以用此模型对固体发酵最优条件进行分析和预测。当发酵条件为水分68.8%、接种量12.8%、发酵天数42.5 d，脱毒率可达到91.4%。采用上述最优条件进行验证试验，试验测得脱毒率为91.3%。表7

表7　优化后结果

3讨 论

3.1从实验室已有菌株、动物新鲜粪便和土壤中选育出10株符合《饲料添加剂品种目录(2013)》中规定的降解棉酚菌株。微生物发酵棉秸秆作为动物饲料，脱毒的关键是菌种的选择。不同微生物菌种对棉酚的降解能力不同，筛选优良的微生物菌种是影响棉秸秆脱毒效果的首要条件。在国内外，常采用单一菌种进行微生物固体发酵脱毒。孙建义等[11]利用假丝酵母进行棉籽饼脱毒的研究，棉酚脱毒率达90.0%以上；杨继良等[12]筛选出脱毒能力较强的酵母菌菌株JM-3，该菌株可降解棉籽饼中80%以上的游离棉酚；顾赛红等[13]利用黑曲霉PES对棉仁粕进行固体发酵，游离棉酚由498.0 mg/kg降为57.0 mg/kg，脱毒率达86.5%。

3.2除了微生物菌种的影响外，固体发酵过程中含水量﹑接种量﹑发酵天数﹑辅料添加等对发酵效果有着很大的影响。贾晓峰[14]利用微生物处理棉籽粕，发酵培养基中添加了麸皮、玉米粉等辅料，料水比为1∶0.9，脱毒率达90.0%左右；聂蓬勃[15]将棉籽粕50.0℃烘干，料水比为1∶1，脱毒率在51.7%。周生飞[16]利用响应面分析法建立棉酚降解率与关键因素之间的二次多项式回归模型，并通过模型求解确定培养基最佳成分和最优发酵条件：Na2CO30.6 g/L，FeSO472.7 mg/L，MgSO40.6 g/L，水分含量 58.1%和发酵时间 31.6 h，预测最大棉酚降解率为 60.94%。通过优化棉秸秆固体发酵条件，建立了关键因子影响棉秸秆脱毒率的二次多项数学模型，系统研究并确定了棉秸秆固体发酵脱毒的工艺条件，为实现棉秸秆微生物发酵作为动物饲料提供了理论依据。通过响应面试验设计得到水分﹑接种量﹑发酵天数对棉酚降解率影响的数学模型。

4结 论

4.1采用醋酸棉酚基础培养基从五家渠棉花种植地土壤、吐鲁番鄯善县鲁克沁镇牧场牛、羊、骆驼新鲜粪便和实验室已有菌株中筛选菌株25株。选育出10株符合《饲料添加剂品种目录(2013)》中规定的降解棉酚菌株。选用不产生拮抗作用的菌株并进行合理组合，确定共生菌株最优配比为QC-3∶QC-5∶QC-9∶QC-10按1∶2∶1∶1。菌株QC-3、QC-5、QC-9、QC-10分别为产朊假丝酵母(Candidautilis)、地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

4.2以生产实际相结合，利用响应面分析法以游离棉酚含量为指标，以发酵水分、接种量、发酵天数为试验因素，进行二次回归中心组合试验设计。通过Design Expert 8.0.6软件对经手动优化后的回归方程求解，在试验的因素水平范围内预测最佳发酵条件为：水分68.8%、接种量12.8%、发酵天数42.5 d，在此条件下脱毒率可达到91.4%。采用上述最优条件进行验证试验，试验测得脱毒率为91.3%。

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Fund project:Supported by the Youth Funds of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences "Screening and Breeding of Highly-Effected Degrading Gossypol Strains and the Detoxification Effect Demonstration" (xjnkq-2014009) and the Basic Science and Technology Research Support Funds of Non-profit Research Institutions of Xinjiang Uygur Autonomous Region "Microbial Treatment Technology of Cotton Stalks" (KY2014028)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.06.019

收稿日期(Received)：2016-01-14

基金项目:新疆农业科学院青年科技基金项目“棉酚降解菌株选育及在棉秆发酵中的初步应用”(xjnkq-2014009); 自治区公益性科研院所基本科研业务经费资助项目“棉秸秆饲料化微生物处理技术研究”

作者简介:侯敏(1983 -)，女，新疆人，助理研究员，研究方向为农业微生物及发酵工程，(E - mail) hmde_092@ 163. com 通讯作者(Cotresponding author):崔卫东(1969-)，男，新疆人，研究员，研究方向为发酵工程，(E - mail)cuwedo@163.com

中图分类号：F303.2 S188

文献标识码：A

文章编号：1001-4330(2016)06-1114-08

Screening and Breeding of Highly-Effected Degrading Gossypol Strains and Study on Defoxication Technology and Conditions

HOU Min, BAO Hui-fang, WANG Ning, ZHANG Fa-qiang, YANG Rong,LONG Xuan-qi, CUI Wei-dong

(ResearchInstituteofAppliedMicrobiology/XinjiangAcademyofAgriculturalSciences/XinjiangLaboratoryofSpecialEnvironmentalMicrobiology,Urumqi830091,China)

Abstract：【Objective】 The project aims at screening and breeding of degrading gossypol strains and studying the defoxication technology and conditions.【Method】From the existing strains in the laboratory, animal feces and different samples of soil were screened and bred degrading gossypol strains were screened and bred to identify the symbiotic strains mixing ratio, then, moisture, inoculation amount, fermentation time and their interactions on the degradation rate of glucosinolate were evaluated by using a response surface method. Based on this, the optimal levels of these factors were determined by Box-Behnken. 【Result】Ten degrading gossypol strains were bred, and the most optimal rate was 1∶2∶1∶1, The high degradation rate of gossypol was observed in fermentation processes under the optimal conditions: the moisture was 68.75%, the inoculation amount was 12.76%, fermentation time was 42.53 d. Under these conditions, the degradation rate of gossypol reached 91.422,9% .【Conclusion】In conclusion, the optimal fermentation conditions of the detoxification conditions are determined. The results can be used as technical parameters and theoretic basis for decreasing the degradation rate of gossypol with mixture strain on cotton stalks.

Key words:cotton stalk; gossypol: detoxication, solid fermentation