马钱苷抑制人恶性黑色素瘤细胞的作用及机制研究

党文军　　陈景华　　张　宁　　王加志　　黄昕红

黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨　150040

马钱苷抑制人恶性黑色素瘤细胞的作用及机制研究

党文军陈景华张宁王加志黄昕红

黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040

目的探索马钱苷抑制人恶性黑色素瘤细胞的作用和机制。 方法将实验分为空白对照组、不同干预浓度（10、20、40、60、80 ng/mL）的马钱苷组，分别作用24、48、72 h，采用MTT方法检测细胞活性；依据药物作用48 h时的IC50浓度［（74.96±7.92）ng/mL］，选取马钱苷20、40、60 ng/mL分别干预48 h，并采用RT-PCR法检测细胞内Bc1-2、Bax和Caspase-3 mRNA表达水平的变化；用Western b1ot检测细胞内Bc1-2、Bax和Caspase-3蛋白水平的变化。 结果马钱苷具有抑制A375细胞增殖的作用，并呈时间和剂量依赖性。与空白对照组比较，马钱苷组细胞抑制凋亡因子Bc1-2的mRNA和蛋白质表达水平均明显下调（P＜0.05或P＜0.01），促凋亡因子Bax和Caspase-3的mRNA及蛋白质表达均明显上调（P＜0.05或P＜0.01）。结论马钱苷能抑制A375细胞增殖，其作用机制可能与下调细胞Bc1-2 mRNA与蛋白质的表达，上调Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白质的表达，进而诱导细胞凋亡有关。

马钱苷；人恶性黑色素瘤；A375细胞；凋亡；Bcl-2；Bax；Caspase-3

［Abstract］Objective To investigate the inhibitory effect and mo1ecu1ar mechanism of 1oganin on human ma1ignant me1anoma ce11s in vitro.Methods The experiment was divided into b1ank contro1 group and different concentrations （10，20，40，60，80 ng/mL）of 1oganin groups，dea1t for 24，48，72 h，the ce11s activity was detected by MTT method；according to the ha1f-inhibitory concentration（IC50）for 48 h［（74.96±7.92）ng/mL］，20，40，60 ng/mL of 1oganin were se-1ected for 48 h intervention.The mRNA expressions of Bc1-2，Bax and Caspase-3 were detected by RT-PCR；the protein expressions of Bc1-2，Bax and Caspase-3 were detected by Western b1ot.Results Loganin has a most effective1y inhibitory effect on A375 ce11s pro1iferation in a time and dose dependent manner.Compared with b1ank contro1 group，the mRNA and protein expression 1eve1s of apoptosis inhibiting factor Bc1-2 in the 1oganin group were down-regu1ated significant1y（P＜0.05 or P＜0.01），and the mRNA and protein expression 1eve1s of pro-apoptotic factors Bax and Caspase-3 were a11 up-regu1ated，respective1y（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Loganin can significant1y inhibit the pro1iferation of A375 ce11s，which may be associated with inhibiting the mRNA and protein expressions of Bc1-2，improving the mRNA and protein expressions of Bax，Caspase-3，thus inducting apoptosis.

［Key words］Loganin；Human ma1ignant me1anoma；A375 ce11s；Apoptosis；Bc1-2；Bax；Caspase-3

人恶性黑色素瘤细胞是一种始于黑素细胞的皮肤恶性肿瘤，其进展快，恶性程度高，极易发生淋巴转移，严重威胁人群生命健康。据2012年统计显示，全球发病232 130例，死亡55 849例，且其发病率正逐年升高。针对该病的治疗方法多样，早期发现可手术切除，对于已经转移的黑色素瘤患者，传统的放化疗、兔疫疗法均对其不敏感［1］。中药山茱萸具有多种生物活性，表现出抗炎、降血糖、抗心律失常、双向调节兔疫、促进白细胞介素-2（IL-2）生成［14］的作用。现代药理研究提示［2-3］，山茱萸对乳腺癌细胞（MCF-7）、艾氏腹水癌细胞（EAC）、人肺癌细胞（A549）等细胞有明显的抗肿瘤活性，是一种具有广泛应用前景的抗癌药。本课题组前期研究提示，高浓度的山茱萸水提取物环烯醚萜苷类成分马钱苷，能显著抑制人黑色素瘤A375细胞的生长［4］，但其作用机制不明确。本研究从细胞及分子水平上探讨了马钱苷抑制人恶性黑色素瘤A375细胞的效应和强度及可能的作用机制，为抗肿瘤新药的开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1细胞株

人皮肤黑色素瘤细胞A375细胞由中国科学院细胞中心提供。

1.2主要药物及试剂

马钱苷（批号：111640-200502）购于中国食品药品检定研究院；HRP标记羊抗小鼠IgG（批号：BST08k13B）、HRP羊抗兔（批号：BA1054），博士德；rabbit ant-Bax（批号：15120902）、rabbit ant-Bc1-2（批号：15120901）、rabbit ant-Caspase-3（批号：15120903）、小鼠抗人β-actin单克隆抗体（批号：140925），中杉金桥。

1.3主要仪器

IX-71-21PH型倒置显微镜（日本O1ympus株式会社）；Tprofessiona1 PCR扩增仪（德国Biometra公司）；MK3型酶标仪（上海热电仪器有限公司）；Cham1Ge 15000凝胶成像仪（北京赛智创业科技有限公司）。

1.4细胞分组及处理

将对数期生长的A375细胞，以5000个/孔接种于96孔板中，每孔加200 μL DMEM完全培养液，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。把培养基弃掉，分别加入含马钱苷药物6种浓度（0、10、20、40、60、80 ng/mL）培养基200 μL，各组细胞均设6个复孔，继续培养24、48、72 h。将另一部分细胞以105个/孔接种于6孔培养板中，每组均设4个复孔，每孔加2 mL DMEM完全培养液，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，把培养基弃掉，分别加入含马钱苷药物4种浓度（0、20、40、60 ng/mL）培养基2 mL，继续培养48 h。

1.5MTT法检测细胞活性

细胞培养分别在24、48、72 h至结束前4 h每孔加20 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h，弃上清，加150 μL DMSO溶解，将96孔板置于37℃恒温震荡培养器内震荡10 min，使紫色结晶完全溶解。酶标仪490 nm波长处测定吸光度。

1.6RT-PCR法检测细胞 Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达

1.6.1总RNA提取细胞总RNA的提取按照试剂盒说明操作。引物设计合成：由上海生工生物工程技术服务有限公司完成设计与合成，以β-actin为内参，引物序列信息见表1。

表1　引物序列

1.6.2PCR扩增 在冰浴离心管中依次加入样品cDNA 1.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 2.5 μL、MgC121.3 μL、Taq酶0.1 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、ddH2O 16.1 μL，使管中终体积达到25 μL，将离心管放入PCR扩增仪上，PCR扩增程序如下：条件：94℃变性30 s（β-actin 50℃、Bc1-2 46℃、Bax 45℃、Caspase-3 48℃）、退火40 s，72℃延伸50 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min。

1.6.3结果分析 采用ge1-pro凝胶分析软件对电泳谱带进行积分光密度（IOD）分析，得出各条带IOD值，用校正值 （Bc1-2/β-action、Bax/β-action、Caspase-3/ β-action）表示mRNA水平。

1.7Western blot检测马钱苷对Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达

1.7.1蛋白样品制备 当细胞呈80%以上融合时，WIP组织细胞裂解液（PMSF终浓度为1 mmo1/L）提取总蛋。SDS-PAGE电泳：按照BIO-RAD公司说明书安装SDS聚丙烯酰氨凝胶玻璃板，加样照实验分组将预染蛋白Marker和等体积的蛋白样品30 μL注入到对应的胶孔中，连接电泳仪，100 V，电泳90 min。转膜封闭：接通电源10 V，30 min将蛋白转至经甲醇5 min和去离子水2 min浸泡后的PVDF膜，室温置摇床封闭2 h。一抗孵育反应，1∶300稀释小鼠抗β-actin单克隆抗体，1∶100稀释Bax、Bc1-2 Caspase-3兔抗人单克隆抗体，脱色摇床上室温孵育PVDF膜1 h后，4℃过夜。1∶10 000稀释HRP标记羊抗小鼠二抗和HRP标记羊抗兔二抗，摇床孵育PVDF膜1 h后，显影：ECL显影液显影。

1.7.2结果分析采用Lane ID凝胶分析系统对条带进行IOD分析，得到各条带的灰度值，以靶条带的灰度值与内参的灰度值的比值来反映目的蛋白的表达水平。

1.8统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1马钱苷对A375细胞活性的影响

试验结果显示，马钱苷对A375细胞增殖具有明显的抑制作用，在同一处理条件下，马钱苷组对A375细胞活性的抑制影响与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）（图1A）；另外，其抑制率分别在24、48、72 h时随剂量依次增大，在一定程度上存在时间效应和剂量效应（图1B）。计算得出，马钱苷在作用48 h时的IC50为（74.96± 7.92）ng/mL。

图1　马钱苷对A375细胞活性和增殖的影响

2.2马钱苷对Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达的影响

试验结果显示，马钱苷能下调A375细胞Bc1-2 mRNA的表达，同时上调Bax和Caspase-3 mRNA的表达，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）（表2）；另外，药物作用48 h时，随药物剂量依次增大，其对Bc1-2、Bax、Caspase-3 mRNA的调节作用越明显，在一定程度上存在剂量效应（图2）。

表2 不同组别的A375细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的相对表达量（±s，n=4）

表2 不同组别的A375细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的相对表达量（±s，n=4）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别　Bc1-2/β-actin Bax/β-actin　Caspase-3/β-actin空白对照组马钱苷组（20 ng/mL）马钱苷组（40 ng/mL）马钱苷组（60 ng/mL）0.654±0.061 0.622±0.048*0.506±0.047**0.396±0.036**0.253±0.018 0.288±0.042*0.389±0.046**0.486±0.036**0.236±0.019 0.303±0.038**0.418±0.030**0.515±0.065**

图2　马钱苷对A375细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的影响

2.3马钱苷对Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响

试验结果显示，马钱苷能下调A375细胞Bc1-2蛋白的表达，同时上调Bax和Caspase-3蛋白的表达，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）（表3）；另外，药物作用48 h时，随药物剂量依次增大，其对Bc1-2、Bax、Caspase-3蛋白的调节作用越明显，在一定程度上存在剂量效应（图3）。

图3　马钱苷对A375细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响

表3　不同组别的A375细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的相对表达量（±s，n=4）

表3　不同组别的A375细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的相对表达量（±s，n=4）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别　Bc1-2/β-actin　Bax/β-actin　Caspase-3/β-actin空白对照组马钱苷组（20 ng/mL）马钱苷组（40 ng/mL）马钱苷组（60 ng/mL）0.554±0.045 0.506±0.011*0.450±0.030**0.320±0.009**0.215±0.016 0.264±0.011*0.363±0.017**0.434±0.015**0.251±0.024 0.335±0.015**0.644±0.023**0.750±0.011**

3　讨论

凋亡是细胞的程序性死亡，是由基因调控的肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞的增长是由细胞增殖与凋亡的比例决定的。细胞凋亡是由多种信号蛋白通过多种途径传导的复杂过程，目前主要是通过死亡受体途径（外部途径）和线粒体途径（内部途径）实现的［5］。凋亡因子Bax、Bc1-2、Caspase-3与线粒体凋亡途径密切相关［6-8］。Bax是Bc1-2家族促凋亡亚家族的代表，定位于细胞浆中，可提高凋亡敏感性，促进细胞凋亡。当细胞内Bax表达较多时，Bax能自身形成同源二聚体［9］，其能不断引起线粒体的膜电位降低，进一步促进cyt-c 和AIF的释放，cyt-c与凋亡酶激活因子（Apaf-1）、ATP 及pro-Caspase-9形成凋亡复合体，通过pro-Caspase-9的自身酶切活化，激活Caspase-9，进一步活化Caspase-3，引起细胞DNA裂解而凋亡［10-11］。Bc1-2是Bc1-2家族抗凋亡亚家族的代表［12］，主要定位于线粒体膜、内质网膜及核膜上，其主要功能为延长细胞寿命，研究提示Bc1-2基因在肿瘤组织中过量表达，并与肿瘤的发生发展密切相关［13］，当Bc1-2表达增多时，Bc1-2与Bax形成异源二聚体，引起细胞核谷胱甘肽积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，阻止胞内Ca2+流动，导致线粒体膜的通透性改变，干扰了线粒体膜释放cyt-c，抑制Caspase-3依赖的线粒体蛋白水解级联反应，从而起到抑制细胞调亡的作用［14-15］，可见Bc1-2和Bax蛋白均位于线粒体上游，是Caspase-3依赖的线粒体途径的重要调控因素［16-19］。部分机制虽是如此，但只有当Bax/Bc1-2值升高，才可认为是Bax真正意义上的表达增多，才是Bax形成同源二聚体促使凋亡的条件［20］。

本研究显示，马钱苷能显著下调Bc1-2的mRNA和蛋白质表达，同时上调Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白质表达，并且随着给药浓度的增大，Bax/Bc1-2值愈大，对A375的抑制作用愈强，与空白对照组比较，具有显著性差异。因此推断，马钱苷可能通过下调Bc1-2 mRNA和蛋白质表达，上调Bax mRNA和蛋白质表达，提高Bax/Bc1-2值，促进cyt-c释放，激活Caspase-3依赖的线粒体途径诱导A375细胞凋亡。这可能是马钱苷抑制恶性黑色素瘤细胞A375增殖的作用机制，这将为治疗人恶性黑色素瘤新药的开发提供一种可能。

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Study on the inhibitory effect and molecular mechanism of loganin on human malignant melanoma cells

DANG WenjunCHEN JinghuaZHANG NingWANG Jiazhi HUANG Xinhong
Hei1ongjiang University of Chinese Medicine，Hei1ongjiang Province，Harbin150040，China

R739.5

A

1673-7210（2016）04（c）-0015-05

黑龙江省自然科学基金面上项目（D201275）。

党文军（1986-），男，黑龙江中医药大学临床医学院2013级中医外科学专业在读硕士研究生；研究方向：中医外科学中医药美容。

陈景华（1965-），女，硕士，教授，硕士研究生导师，主要从事中医外科学中医药美容研究。

2016-01-02本文编辑：张瑜杰）