PowerPlex®21试剂盒扩增后的分型图谱中Y片段丢失的识别

汪三存，丁美满，魏晓林，张　涛，姚　斐（.嘉兴市公安局刑侦支队DNA实验室，浙江 嘉兴 3400；.嘉兴市公安局南湖区分局刑侦大队，浙江嘉兴 34000）



PowerPlex®21试剂盒扩增后的分型图谱中Y片段丢失的识别

汪三存1，丁美满1，魏晓林1，张涛2，姚斐1
（1.嘉兴市公安局刑侦支队DNA实验室，浙江 嘉兴 314001；2.嘉兴市公安局南湖区分局刑侦大队，浙江嘉兴 314000）

摘要：目的 依据分型图谱，直观、简便识别是否存在Amelogenin基因Y片段丢失的可能。方法 采用计算分型图谱中等位基因峰高之和比值的方法，统计1 968份人员样本经PowerPlex®21试剂盒扩增后Amelogenin与D3S1358基因座之间的均衡性、Amelogenin X等位基因与Amelogenin Y等位基因的均衡性以及D3S1358基因座不同等位基因的均衡性情况。结果 90.8%的女性样本Amelogenin X等位基因峰高不低于D3S1358基因座等位基因峰高和的60%，94.9%的男性样本Amelogenin X等位基因的峰高不超过D3S1358基因座等位基因峰高和的70%。结论 PowerPlex®21试剂盒扩增后的分型结果中，当Amelogenin基因只检测到Amelogenin X等位基因，且Amelogenin X等位基因的峰高不及D3S1358基因座等位基因峰高之和的70%时，应考虑存在Y片段丢失的可能性。

关键词：法医遗传学；DNA指纹法；基因频率；Amelogenin基因

STR和Amelogenin复合扩增所得到的分型图谱中，正常男性样本得到X染色体和Y染色体特异的2种PCR产物片段，正常女性样本则仅有X染色体特异的1种PCR产物片段。但是，有些男性个体因Amelogenin基因突变［1］导致Y染色体特异扩增后无产物，显示为类似女性样本的一条谱带，易造成结果误判。本研究通过对1968份经PowerPlex®21试剂盒扩增的人员样本的分型结果进行统计分析，拟验证依据分型图谱中Amelogenin X等位基因与毗邻的D3S1358基因座等位基因峰高之和的比值，可直观识别Y染色体扩增片段是否缺失。

1　材料与方法

1.1研究对象

实验室人员数据库建设中受理的人员唾液FTA 卡1968份，其中女性样本355份，男性样本1613份。

1.2主要仪器与试剂

BSD600-Duet全自动打孔仪（澳大利亚BSD公司），9700型PCR仪（美国原AB公司），3130xl型和3500xl型遗传分析仪（美国AB公司），PowerPlex®21试剂盒（美国promega公司）。

1.3DNA分型方法

1 968份唾液 FTA卡经 BSD600打孔（孔直径1.2mm），采用PowerPlex®21试剂盒在9700型PCR仪上进行复合扩增，扩增产物应用3130xl型或3500xl型遗传分析仪进行检测，结果用GeneMapper ID-X1.4软件进行分析。

1.4数据分析

依据GeneMapper ID-X1.4软件的图谱质量评分系统对每个图谱的质量进行评分，选取符合判读质量要求的样本，共分成四组：D3S1358基因座为纯合子的男性样本组（M-1组）、D3S1358基因座为杂合子的男性样本组（M-2组）、D3S1358基因座为纯合子的女性样本组（F-1组）和D3S1358基因座为杂合子的女性样本组（F-2组）。

分型图谱中，等位基因的峰面积按三角形的面积计算方式处理，但峰的底边长度相较峰高的高度对于峰面积的影响可以忽略。因此，等位基因峰高的比值可以代表其均衡性［2］。均衡性计算公式：（HX+HY）/（HA+ HB）=（Amelogenin的 height1+height2）/（D3S1358的height1+height2）。式中HX表示Amelogenin X等位基因的峰高，HY表示Amelogenin Y等位基因的峰高，HA、HB表示D3S1358基因座的等位基因峰高，height1 和height2是GeneMapper ID-X1.4软件中表示等位基因峰高的值。

女性样本的HY和D3S1358基因座为纯合子时的HB均为零。由于HA、HB只是与D3S1358基因座的height1、height2值对应，可能HA＞HB，也可能HA＜HB，因此，计算均衡性时存在HA=70%HB和HB=70%HA两种情形，同样道理，Amelogenin基因座与D3S1358基因座之间的均衡性、Amelogenin基因座X等位基因与Y等位基因之间的均衡性均包含两种情形。

2　结果

2.1均衡性结果

根据标准［3］规定，复合扩增的分型结果中，同一基因座杂合子的均衡性不低于70%、毗邻基因座的均衡性不低于50%。本研究1968例样本中1927例（其中女性样本346列，男性样本1581例）的分型结果符合判读要求。统计四组样本的Amelogenin与D3S1358基因座等位基因峰高之和的比值，计算各组样本的Amelogenin基因座与D3S1358基因座间的均衡性和Amelogenin基因座、D3S1358基因座上不同等位基因的均衡性结果（表1）。

表1　1927例样本Amelogenin与D3S1358基因座间、Amelogenin和D3S1358基因座上不同等位基因的均衡性分布　（%）

本研究中，没有发现男性样本在Amelogenin基因座出现Y片段丢失的情形。表1结果显示，Power-Plex®21试剂盒扩增后的分型结果中，超过82%的样本Amelogenin与D3S1358基因座间的均衡性大于70%，超过91%的样本Amelogenin X等位基因与Amelogenin Y等位基因、D3S1358基因座的不同等位基因的均衡性大于85%。90.8%的女性样本Amelogenin X等位基因峰高不低于D3S1358基因座等位基因峰高和的60%，94.9%的男性样本Amelogenin X等位基因的峰高不超过D3S1358基因座等位基因峰高和的70%。

2.2案例应用

2014年3月18日，嘉兴市某宾馆房间内发生一起强奸案。受害人阴道擦拭物的PowerPlex®21分型图谱中，显示Amelogenin基因座只有Amelogenin X等位基因（图1）。并且，Amelogenin X等位基因的峰高与D3S1358基因座等位基因的峰高之和比值为：［19433/（14791+14879）］×100%=65.5%，应考虑Y片段丢失的可能。该检材的DNA模板用PowerPlex® Y23试剂盒扩增，获得了Y-STR数据（图2），证实Amelogenin基因的Y片段存在缺失。破案后，嫌疑人的唾液FTA卡的STR分型结果（图3）与受害人阴道擦拭物的分型相同。

3　讨论

按照（HX+HY）/（HA+HB）=（Amelogenin的height1+ height2）/（D3S1358的 height1+height2）计算时，若（HX+HY）＜（HA+HB）且HX＜HY，则Amelogenin X等位基因峰高与D3S1358基因座峰高之和的比值最小。此种情形下，女性样本的Amelogenin X等位基因峰高与D3S1358基因座峰高之和的比值约为 60%，即70%×85%≈60%；男性样本的Amelogenin X等位基因峰高与D3S1358基因座峰高之和的比值约为42%，即70%×70%×85%≈42%。

作为初步识别判断方法，可将此比值标准适当放大至更为保险的70%，即当分型图谱中只显示有Amelogenin X等位基因，且Amelogenin X等位基因的峰高不及D3S1358基因座峰高之和的70%时，应该考虑存在Y片段丢失的可能性。

当考虑Amelogenin基因有Y片段丢失可能时，可以通过：（1）用增加了Y染色体性别决定序列的扩增试剂盒（如AB公司的GlobalFiler®试剂盒包含Y-indel和DYS391）进行检验。（2）Y-STR验证。（3）有条件的还可采用家系调查、直接测序等方法进行验证、确认。

参考文献：

［1］曹志华，孙亚男，唐立冈，等.Y染色体Amelogenin基因变异1例［J］.济宁医学院学报，2014，37（2）：122-123.

［2］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求：GA/T 815—2009［S］.北京：中国标准出版社，2009.

［3］中华人民共和国公安部.人类DNA荧光标记STR分型结果的分析及应用：GA/T 1163—2014［S］.北京：中国标准出版社，2014.

（本文编辑：柳燕）

中图分类号：DF795.2

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.008

文章编号：1004-5619（2016）03-0193-03

作者简介：汪三存（1976—），男，主检法医师，主要从事法医DNA研究；E-mail：wsc1976@sina.com

收稿日期：（2015-09-06）

Recognition of Y Fragment Deletion by Genotyping Graphs after Amplified by PowerPlex®21 Detection Kit

WANG San-cun1，DING Mei-man1，WEI Xiao-lin1，ZHANG Tao2，YAO Fei1
（1.DNA Lab of Criminal Investigation Detachment，Jiaxing Public Security Bureau，Jiaxing 314001，China；2.Criminal Investigation Team，Nanhu District Branch Bureau，Jiaxing Public Security Bureau，Jiaxing 314000，China）

Abstract：Objective To recognize the possibility of Y fragment deletion of Amelogenin gene intuitively and simply according to the genotyping graphs.Methods By calculating the ratio of total peak height of genotyping graphs，the statistics of equilibrium distribution between Amelogenin and D3S1358 loci，Amelogenin X-gene and Amelogenin Y-gene，and different alleles of D3S1358 loci from 1968 individuals was analyzed after amplified by PowerPlex®21 detection kit.Results Sum of peak height of Amelogenin X allele was not less than 60%that of D3S1358 loci alleles in 90.8%female samples，and sum of peak height of Amelogenin X allele was not higher than 70%that of D3S1358 loci alleles in 94.9%male samples.Conclusion The result of genotyping after amplified by PowerPlex®21 detection kit shows that the possibility of Y fragment deletion should be considered when only Amelogenin X-gene of Amelogenin is detected and the peak height of Amelogenin X-gene is not higher than 70%of the total peak height of D3S1358 loci.

Key words：forensic genetics；DNA fingerprinting；gene frequency；Amelogenin gene