Biolog-Eco法检测尸体微生物群落的代谢功能变化

江鑫钰，王江峰，朱光辉，马孟云，赖　跃，周　晖（．汕头大学医学院，广东 汕头 5504；．苏州大学医学部法医学系，江苏 苏州 5；．深圳市公安局刑警支队，广东 深圳 58040）



Biolog-Eco法检测尸体微生物群落的代谢功能变化

江鑫钰1，王江峰2，朱光辉1，马孟云3，赖跃3，周晖3
（1．汕头大学医学院，广东 汕头 515041；2．苏州大学医学部法医学系，江苏 苏州 215123；3．深圳市公安局刑警支队，广东 深圳 518040）

摘要：目的 检测死后不同时间尸体上微生物群落功能多样性的变化并评估其在死亡时间推断中的应用价值。方法 采用Biolog-Eco微平板对野外实验中来自于死后0～240h猪和人尸体的肛门拭子进行微生物群体的培养，监测其引起的光密度值变化，结合法医病理学及蝇类演替，观察自然腐败尸体微生物群落的代谢特性及其变化。结果 微生物代谢功能多样性与蛆虫数量变化呈负相关关系。冷冻在0h对每孔颜色平均变化率影响最大，48h后基本消失，192h后尸体微生物群落多样性相对不稳定。主成分分析将31种碳源综合为5个主成分（累积贡献率＞90%）。碳源tsquare分析显示，N-乙酰-D-葡萄糖氨和L-丝氨酸是推断人和猪样品PMI（0～240h）的优势碳源。结论 Biolog-Eco法能表现死亡后0～240h尸体上微生物群落对部分碳源利用的代谢差异，有望为死亡时间推断提供新依据。

关键词：法医病理学；微生物学；代谢；Biolog生态板

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断一直是法医学领域重要的研究课题之一，法医学者已经从尸体现象、直肠温度变化、眼球玻璃体化学物质的变化、核酸的变化［1］、昆虫演替［2］等多角度进行了研究，但并没有促成该问题的完美解决。

尸体腐败的主要外界原因是昆虫和微生物的共同作用，近年来对尸体上活的生物（昆虫）进行了大量研究［3］。Biolog-EcoPlate（以下简称Biolog生态板）技术是一种广泛应用的研究微生物的方法，通过微生物对不同碳源的消解来反映微生物的种类及群落特征。尸

1　材料与方法

1.1腐败过程模拟和样品采集

本次野外实验于2013年8月在深圳市公安局法医检验中心（22°37′51.15″N，114°09′14.79″E）进行，该地属南亚热带海洋季风气候，全年温和暖湿，属于中国的高温多雨地区［6］。本实验采用人（冷冻尸体解冻至室温后进行，尸长170 cm、质量49.5 kg）和猪（质量40.5kg）尸体进行野外腐败模拟实验。其中人尸体系捐赠，猪直接从市场购买，用铁锤击打颅顶处死。在相同时间将人尸体和猪尸体置于相同的野外环境，进行法医病理学、昆虫学及微生物学变化观察。对人和猪尸体分别取其死后（人尸体为解冻后）0、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h的肛门拭子标本各1份，用testo175-H1电子温湿度记录仪（德国TESTO公司）分别记录人、猪直肠温度（距离肛门约10cm）和环境温度。

1.2微生物悬浮液的制备和Biolog生态板的接种

分别在装有肛门拭子的微量离心管中加入1mL 的Tris盐缓冲液（0.01 mol/L），5℃下涡旋振荡1 h （140 r/min），拭子在无菌条件下从溶液中取出，加入另一只微量离心管，重复上述操作2次；合并处理液，在500×g下离心2min，除去颗粒杂质。上清液倒入第二无菌离心管中，在8000×g下离心10min，用Tris盐缓冲液反复洗涤4～6次，沉淀物为微生物细胞。倒出Tris盐缓冲液并用相同体积质量浓度为8.5 g/L的无菌NaCl溶液取代。涡旋振荡2min，使细胞悬浮，装入比色管。将样品用无菌的NaCl溶液稀释，使D590维持在0.13±0.02［7］。将制备好的菌悬液加入Biolog生态板（Biolog-EcoPlateTM，美国BIOLOG公司）中（150μL/孔），在30℃下培养，每隔12h用Multiskan Spectrum全波长酶标仪（美国Thermo Electron公司）读取590nm和750nm下的光密度值（D590和D750），连续测定240h［8］。

温度可能是影响微生物存活和生长的最重要的因素［9］，BIOLOG公司建议最好选择最有利于有机体生存和生长的温度培养生态板，按照标准培养温度而不按照实际环境温度培养温度培养微生物可能会增加所监测的微生物代谢模式的偏差［10-12］，为便于平行对照，选择死后0～480h的肛温均值的近似值30℃作为培养温度，该温度高于Biolog生态板的一般培养温度（25℃）。

1.3数据处理

1.3.1微生物代谢活性

用每孔颜色平均变化率（average well color development，AWCD）来描述。AWCD是每个碳源孔D590减去D750，再减去对照孔光密度值后取31种碳源的平均值［13］。

1.3.2微生物群落代谢功能的多样性

Biolog生态板温育72～96h时，微生物对碳源的利用基本稳定，即光密度的变化趋于稳定［14］，因此选取96h的光密度值进行分析，采用香农多样性指数（H′）、香农均度指数（SE）、Mclntosh指数（U）和Mclntosh均匀度（Mclntosh evenness，ME）指数来反映微生物群落代谢功能的多样性及评估丰富度和均度。H′和SE显示了微生物群落功能多样性的高低，该指数包含两个因素：其一是平均光密度值，即丰富度，当全板的光密度值为0时，H′达最小值0；其二是种类中个体分配上的均匀性，即各孔光密度值变化的均匀性增加也会使多样性提高。丰富度指数（S）表示颜色变化孔的数目，微孔的光密度值≥0.2，则认为是阳性值，并计入微生物群落的丰富度。U与ME是基于群落物种多维空间上欧式距离的多样性指数。

1.3.3碳源代谢指纹图谱

以微生物对三大营养物质的代谢途径将生态板上的31种碳源分成4大类：糖类及其衍生物、氨基酸及其衍生物、脂肪酸和脂类、代谢中产物和次生代谢物，分别占12种、6种、5种和8种。

1.3.4主成分分析（principal component analysis，PCA）

将Biolog生态板的31种碳源测定结果形成的描述微生物群落代谢特征的多元向量变换为互不相关的主元向量（如PC1、PC2等主元向量的分量），在降维后的主元向量空间中可以用点的位置直观地反映其不同的底物利用特征。

1.3.5统计分析

本实验采用SPSS软件对所测得的光密度值进行差异显著性及相关性分析，用Matlab统计软件进行主成分分析（PCA矩阵及霍特林T2）。检验水准α=0.05。

2　结果

2.1人、猪直肠温度及环境温度变化

实验期间人、猪尸体温度及环境温度变化见图1。环境温度变化趋势较平稳，平均气温为29.0℃（最高32.8℃，最低25.6℃）；猪直肠温度在0～24 h呈下降趋势，24～48 h上升至环境温度，之后持续上升并在168h出现最高温度43.7℃，之后呈下降趋势，并在240h降至环境温度；人直肠温度在0～48h从较低的解冻后温度上升至环境温度，无尸冷的过程，24 h后的变化趋势同猪直肠温度。

2.2第一波蝇类昆虫的发生情况

所检测的0～240 h是第一波蝇类昆虫大头金蝇和绯颜裸金蝇的活跃期，在人尸体及猪尸体上两种蝇类的出现情况一致，按幼虫、蛹和成虫的发生情况进行分级统计见表1。

2.3AWCD值的变化特征

对猪和人尸体上死后不同时期肛门拭子制得的菌悬液进行培养，监测得其各个时间点的AWCD值，采用培养96h的Biolog生态板光密度值绘得人和猪样品的AWCD值变化曲线（图2）。

表1　不同死亡时间人类及猪尸体上第一波蝇类的发生情况

猪样品的AWCD值在0～24 h呈下降趋势，在24～48 h回升，48～96 h呈急剧下降趋势，96～144 h有轻微回升，168～240h趋于较低水平；人样品的AWCD值在0h较猪样品低，在72h升高到与猪样品同等水平，并在72～240h的变化趋势同猪样品一致。

人和猪AWCD值相关性分析：0～240h的相关系数为0.769（P＜0.05）；剔除0h的AWCD值，相关系数为0.905（P＜0.05）；剔除0～48 h的AWCD值，相关系数为0.930（P＜0.05）。

2.4微生物多样性指数

猪和人尸体上微生物群落的多样性指数见表2～3。

表2　猪尸体不同PMI微生物群落的多样性指数　（±s）

表2　猪尸体不同PMI微生物群落的多样性指数　（±s）

PMI/h　S多样性指数H′　SE　U　ME 0 15　3.370±0.047　1.022±0.014　5.768±0.830　0.988±0.005 24　21　3.328±0.052　1.021±0.016　4.587±0.681　0.981±0.004 48　25　3.316±0.054　1.018±0.016　6.101±1.071　0.983±0.009 72　17　3.280±0.057　1.019±0.018　5.064±0.885　0.978±0.006 96　18　2.806±0.088　1.219±0.038　1.740±0.224　1.028±0.002 120　15　2.629±0.097　1.142±0.042　2.370±0.363　1.001±0.004 144　17　3.103±0.072　1.036±0.024　3.341±0.545　0.971±0.003 168　11　2.226±0.108　1.242±0.060　1.967±0.311　1.031±0.007 192　5　1.519±0.111　1.096±0.080　1.787±0.360　0.948±0.016 216　6　1.610±0.098　1.161±0.071　1.776±0.432　0.872±0.023 240　4　1.937±0.106　1.081±0.059　2.238±0.556　0.902±0.021

表3　人尸体不同PMI微生物群落的多样性指数　（±s）

表3　人尸体不同PMI微生物群落的多样性指数　（±s）

PMI/h　S多样性指数H′　SE　U　ME 0　27　2.889±0.086　1.067±0.032　3.091±0.505　0.984±0.004 24　26　3.083±0.074　1.013±0.024　4.734±0.963　0.965±0.010 48　26　3.301±0.055　1.026±0.017　4.252±0.567　0.984±0.003 72　25　2.733±0.094　0.965±0.033　7.289±3.116　0.939±0.139 96　10　3.179±0.065　1.100±0.023　3.017±0.493　0.995±0.003 120　10　3.059±0.076　1.130±0.028　2.748±0.315　1.016±0.002 144　20　2.999±0.079　1.059±0.028　3.968±0.743　0.979±0.008 168　6　2.675±0.096　1.115±0.040　2.533±0.386　0.997±0.004 192　4　1.698±0.103　1.055±0.064　2.437±0.823　0.851±0.061 216　4　2.329±0.103　1.300±0.058　2.148±0.379　1.044±0.010 240　6　1.728±0.107　1.247±0.077　1.425±0.219　0.988±0.006

人样品H′值：在0～48 h呈上升趋势，在72 h降低，在96 h回至之前水平，96～240 h呈下降趋势，并在216 h时间点有短暂回升；相隔每24 h的人样品H′指数差异均有统计学意义，其中差异最小值出现在120～144 h（P＜0.05），差异最大值出现在168～192 h （P＜0.05）。猪样品H′值：在24～48h该指数差异无统计学意义（P＞0.05），其余时间点差异均有统计学意义（P＜0.05）。

SE值在人和猪的样品上均较平稳。

U值在人样品的变化趋势为：0～24h该指数呈上升趋势、24～48h呈轻微下降趋势、48～72 h呈显著上升趋势、并在72～96h急剧下降，之后趋向较低值。猪样品U值的变化趋势在72h以后与人样品的变化相同，但在0、48h两个时间点上显著高于人样品。

ME值在人和猪的样品上表现较平稳（表2）。

2.5碳源代谢指纹变化

对样品的碳源代谢指纹变化见图3。对四大类营养物质的代谢随PMI的增加总体上呈降低趋势，在死亡早期（0～72 h）尸体上的微生物对四大类营养物质的利用较均衡，后期则变化幅度较大；在死后192～240 h尸体上微生物群落对脂肪酸和脂类、氨基酸及其衍生物的利用占相对优势。

2.6主成分分析

（1）PCA矩阵：考察猪样品PCA矩阵，第一、第二主成分的贡献率分别为53.9393%、16.1919%，前4个主成分的贡献率达87.9951%，前5个主成分的贡献率达91.2063%；考察人样品PCA矩阵，第一、第二主成分的贡献率分别为49.569 9%、22.693 1%，前4个主成分的贡献率达86.793 6%，前5个主成分的贡献率达90.7285%，均采用前5个主成分。

（2）根据霍特林T2统计量寻找极端数据：将碳源的tsquare从小到大进行排序，并与PMI一起显示。猪样品碳源tsquare分析显示，N-乙酰-D-葡萄糖氨是距离中心最远的碳源，其次是吐温80、L-丝氨酸、苯乙胺；人样品碳源tsquare分析显示，D-甘露醇是距离中心最远的碳源，其次是D-苹果酸、N-乙酰-D-葡萄糖氨、L-丝氨酸。

3　讨论

微生物是自然界广泛存在的一类生物，即使是一个活着的人，身体上的微生物数量也是其体细胞的十倍。而对于尸体，其微生物种类和数量更为繁多，在命案现场，很多尸体上会出现白色或灰色的霉斑，即霉尸。此外，在室内的命案现场，经常能发现饭菜长霉。近年来，随着微生物检测手段的提高，尸体上的微生物逐渐成为法医学的研究热点，由此而形成的一门学科就是法医微生物学（forensic microbiology）或者法医真菌学（forensic mycology）。

本研究采用Biolog生态板技术对人尸体和猪尸体240h以内的微生物变化进行了观察，分别采用平均光密度值、微生物功能多样性指数、碳源代谢指纹图谱、主成分分析对微生物群落的变化情况进行了检测。可以看出在早期死亡阶段（约0～24h）死亡引发了机体正常菌群代谢功能的降低，之后是腐生菌群的繁盛期和尸食性蝇类一龄幼虫期（约24～48 h），然后出现的AWCD值急剧下降期及蛆虫的最繁盛时期 （约48～144h），说明大量蛆群的存在抑制了尸体上微生物群落的代谢功能，可能由于蛆虫分泌物中有抗菌肽的成分能够抑制和杀灭细菌［15］；在晚期（约168～240 h）由于营养物质的消耗，微生物群落的代谢功能趋于较低水平，结合组织形态学的观察，144h会阴处已出现破口，取材部位覆盖的软组织减少，240h取材部位已暴露，能受到阳光照射，易受外来微生物污染，可能证实了在192 h后微生物代谢功能多样性相对不稳定的原因。人和猪AWCD值的相关性研究说明了冷冻对于尸体腐败0h的影响最大，而冷冻对AWCD值的影响在24h后明显减弱，48h后基本消失。微生物总体活性随PMI的增加快于尸体肛温的变化，反映尸体上微生物群落的代谢可导致尸温的升高。同时，微生物群落对碳源底物利用的变化可间接反映当时尸体上营养物质的变化，糖类及其衍生物随PMI的增加而减少，这可能是由于大多数的微生物都能稳定利用糖类，而脂肪酸及脂类、氨基酸及其衍生物随PMI增加在尸体上残留的比例相对增高。主成分分析显示，31种碳源可综合为5个主成分（累积贡献率＞90%），N-乙酰-D-葡萄糖氨和L-丝氨酸是推断人和猪样品PMI（0～240h）的优势碳源。

尸体的腐败首先通过微生物的改变（真菌或者微生物）开始，随后才是一系列节肢动物的到达和嗜尸性昆虫优势的显现，在尸体上蝇类幼虫繁盛之前即死后0～24h增加数个取样时间点可能有益于对PMI更精确的推断。在腐败中晚期尸体上的微生物种群更替速度较早期更快，且受外界环境影响较大，尤其是空气湿度（尸体水分含量）；Biolog生态板培养对象为好氧且相对生长较快的微生物类群，对于腐败后期霉菌等真核微生物群体占主导的代谢模式无法呈现。

在计算微生物多样性指数时，本研究用的是培养96h的光密度值，不同研究人员在不同的报道中所采用的时间和方法并不统一，如采用72、96或120h［16］，应按照群落在培养过程中进入对数期的快慢来选择，一般来说未经冷冻的尸体微生物群落进入对数期的速度快于冷冻尸体，腐败早期尸体微生物群落进入对数期的速度也快于后期。在有限的培养时间内，前者进入对数期前的适应期更短，生长曲线更接近于“S”型，后者更接近于“J”型。

由于利用人类尸体开展研究涉及伦理、宗教及道德等各方面问题，从而使得此类研究很难开展。本研究通过合法途径采用了捐赠的人类材料，还有待未来多地的重复试验才能得出结论，试验结果只作为特定的相似环境（深圳，高温多雨）下尸体腐败的参考，本研究所获取的昆虫学数据将另文报道。

由于我国尚无局部地区每小时的详细气象数据（如风力、日照、紫外线指数、湿度、雨量、雨水质量、土壤、水纹数据等）的公开网站，使得气候因素作为输入数据来推断PMI受到阻碍，某些重要观测值受到忽略，因此加强各学科、机构的合作是腐败尸体PMI推断的趋势。

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（本文编辑：张建华）

中图分类号：DF795.1

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.003

文章编号：1004-5619（2016）03-0171-05

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81273352）

作者简介：江鑫钰（1988—），女，硕士研究生，主要从事法医微生物学研究；E-mail：24273392@qq.com

通信作者：王江峰，男，教授，主要从事法医昆虫学研究；E-mail：wjf701125@aliyun.com 朱光辉，男，副教授，主要从事法医昆虫学研究；E-mail：ghzhu@126.com体上的微生物种类繁多，大部分在实验室无法培养［4］，Biolog生态板技术最大的特征是不用进行微生物各种类的提纯及培养。尸体上的微生物是一种发展迅速、代谢水平高的生物类群，适合用该法研究；同时，Biolog生态板技术操作简单、快速、获得数据量丰富［5］。本研究采用该方法对猪和人尸体上微生物群落随PMI的变化情况进行观察。

收稿日期：（2015-01-06）

Detection of Metabolism Function of Microbial Community of Corpses by Biolog-Eco Method

JIANG Xin-yu1，WANG Jiang-feng2，ZHU Guang-hui1，MA Meng-yun3，LAI Yue3，ZHOU Hui3
（1.College of Medicine，Shantou University，Shantou 515041，China；2.Departmet of Forensic Medicine，Medical College of Soochow University，Suzhou 215123，China；3.Criminal Police Branch，Shenzhen Public Security Bureau，Shenzhen 518040，China）

Abstract：Objective To detect the changes of microbial community functional diversity of corpses with different postmortem interval（PMI）and to evaluate forensic application value for estimating PMI. Methods The cultivation of microbial community from the anal swabs of a Sus scrofa and a human corpse placed in field environment from 0 to 240h after death was performed using the Biolog-Eco Microplate and the variations of the absorbance values were also monitored.Combined with the technology of forensic pathology and flies succession，the metabolic characteristics and changes of microbial community on the decomposed corpse under natural environment were also observed.Results The diversity of microbial metabolism function was found to be negatively correlated with the number of maggots in the corpses.The freezing processing had the greatest impact on average well color development value at 0h and the impact almost disappeared after 48 h.The diversity of microbial metabolism of the samples became relatively unstable after 192 h.The principal component analysis showed that 31 carbon sources could be consolidated for 5 principal components（accumulative contribution ratio＞90%）.The carbon source tsquare-analysis showed that N-acetyl-D-glucosamine and L-serine were the dominant carbon sources for estimating the PMI（0=240h）of the Sus scrofa and human corpse.Conclusion The Biolog-Eco method can be used to reveal the metabolic differences of the carbon resources utilization of the microbial community on the corpses during 0-240 h after death，which could provide a new basis for estimating the PMI.

Key words：forensic pathology；microbiology；metabolism；Biolog-EcoPlate