24个Y-STR基因座荧光标记复合扩增体系的建立

刘　宏，李　越，刘长晖，刘　超，葛斌文，陈林丽（.广州市刑事科学技术研究所 广东省法医遗传学重点实验室，广东 广州 50030；.无锡中德美联生物科技有限公司，江苏 无锡 474）



24个Y-STR基因座荧光标记复合扩增体系的建立

刘宏1，李越1，刘长晖1，刘超1，葛斌文2，陈林丽2
（1.广州市刑事科学技术研究所 广东省法医遗传学重点实验室，广东 广州 510030；2.无锡中德美联生物科技有限公司，江苏 无锡 214174）

摘要：目的 构建包含24个Y-STR基因座的荧光标记复合扩增体系。方法 选择DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a/b、DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570、DYS385a/b、DYS444 24个Y-STR基因座，构建荧光复合扩增体系。检测该体系的特异性、同一性、灵敏度、扩增均衡性、抗干扰性和准确性，调查其在广东地区人群的基因多样性。结果 建立的复合扩增体系在检测的非人类及女性样本中未发现谱带，同一个体不同组织检测结果一致，0.1ng以上标准品9948可检测获得完整分型结果。常见抑制物中体系内加入120～200μmol/L血红素、1.5～2.0mmol/L钙离子时出现等位基因丢失，对靛蓝、腐殖酸、EDTA具有较强抗干扰性。通过146例无关个体与Yfiler系统平行检测比对，24 Y-STR检测体系分型准确。广东地区人群单倍型多样性（HD）为0.99972，优于Yfiler系统（HD=0.99858）。结论 本研究建立的24个Y-STR基因座荧光标记复合扩增体系法医学应用前景广阔，可用于案件检验、亲权鉴定与Y-STR数据库建设。

关键词：法医遗传学；Y染色体；短串联重复序列；荧光复合扩增

荧光标记复合扩增检验是目前应用最广泛的检验技术之一［1］，基于这一技术开发的各种商品化试剂盒，如PowerPlex®Y试剂盒与AmpFeSTR®Yfiler®试剂盒（简称Yfiler试剂盒）等，已经在法医DNA检验中得到了广泛应用［2］。但这些试剂盒主要选取欧美人群的推荐基因座进行研发，其中不少基因座在中国人群中多态性较低，如在中国人群中的基因多样性（GD）DYS391小于0.4［3］、DYS438小于0.5［4］，加之基因座数量少，导致检验系统在中国人群中整体识别力低，在

1　材料与方法

1.1样本及模板制备

种属特异性检测样本：牛、羊、猪、猫、狗、鸡、鼠、鱼和大肠杆菌样本（来源于广州市刑事科学技术研究所科研积累）。性别特异性检测样本：女性无关个体血样10例。个体同一性检测样本：同一男性个体取肌肉组织、血痕、口腔拭子共10例。准确性及基因多样性检测样本：男性无关个体血样146例（在知情同意下取自广州市刑事科学技术研究所日常检案）。上述样本采用Freedom EVO工作站（瑞士Tecan公司）提取DNA［6］。

灵敏度检测模板制备：取标准品9948（美国Ori-Gene公司）加水稀释至每份模板含9948分别为1.0、0.5、0.25、0.1、0.05、0.02ng。

抗干扰性检测模板制备：分5组，向0.5 ng标准品9948中，分别加入血红素、靛蓝、腐殖酸、钙离子、EDTA等抑制物。模板中抑制物浓度分别为：血红素80、120、160、200μmoL/L，靛蓝500、750、1000μmoL/L，腐殖酸5、10、20 ng/μL，钙离子1.0、1.5、2.0 mmoL/L，EDTA 0.6、0.8、1.0μmoL/L。

1.2引物序列、荧光标记与引物浓度

Y-STR检测体系引物序列、引物浓度及荧光标记见表1。荧光标记引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

表1　24 Y-STR检测体系引物序列、体系引物浓度、荧光标记及产物片段大小

续表1

1.3复合扩增体系、扩增程序与电泳检测

扩增体系组成：PCR缓冲混合液（Tris-HCl buffer 125 mmoL/L，KCl 125 mmoL/L，dNTPs 7.5 mmoL/L、MgCl22.0mmoL/L）10.0μL；引物（浓度0.04～1μmol/L，见表1）5.0μL；热启动Taq酶（5U/μL）0.8μL；DNA模板与ddH2O补足至25.0μL。扩增程序：95℃ 11min；94℃ 1min，59℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；60℃60min。扩增产物在3130xl型遗传分析仪上电泳。

1.4等位基因命名及等位基因分型标准物的制备

使用非荧光标记引物对无关个体样本进行单基因座扩增，DYS385a/b、DYS527a/b与DYS459a/b双拷贝基因座等位基因数为2时，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色后，切取不同片段大小条带，进行纯化回收，对扩增产物进行测序，根据测序结果按重复单位的重复次数命名各等位基因。选取不同等位基因样本，用荧光标记引物单基因座扩增后混合扩增产物，制成等位基因分型标准物。

1.5准确性检测与基因多样性统计分析

对146例广东地区男性无关个体，应用本研究建立的24 Y-STR检测体系与Yfiler试剂盒平行检测。DYS385a/b、DYS527a/b与DYS459a/b为双拷贝基因座，分型结果作为一个单倍型进行统计。比较两系统共有的DYS365、DYS385a/b基因座分型结果。用直接计数法计算各等位基因频率，基因座第i个等位基因的频率Pi=第i个等位基因频数/n（n为群体样本数）。GD及单倍型多样性（HD），按公式HD=n（1-∑Pi2）/（n-1）计算，n为样本例数，Pi为等位基因（或单倍型）频率。并计算累积GD值（TGD），按公式TGD＝1-（1-GD1）（1-GD2）……（1-GDn）计算，GDn为各基因座的GD值。

2　结果

2.124 Y-STR检测体系性能评估

本研究建立的24 Y-STR检测体系，等位基因分型标准物峰高均衡、明确，等位基因覆盖完整（图1）。

特异性检测结果：对牛、羊、猪、猫、狗、鸡、鼠、鱼和大肠杆菌等种属样本及女性无关个体样本检验结果均未检见谱带。

个体同一性检测结果：对10例男性个体肌肉、血痕、口腔拭子样本检测，结果均获得相同分型。

灵敏度检测结果：标准品9948模板量在0.1～1ng时所有基因座结果准确、均衡，无非特异性峰，同色荧光RFU值差异小于50%（图2），0.05、0.02 ng模板量出现等位基因丢失。

抗干扰性检测结果：对加入不同抑制物的0.5ng标准品9948进行检测，除加入血红素浓度为120～200μmoL/L、钙离子浓度为1.5～2.0mmoL/L时出现等位基因丢失现象，其他均未出现等位基因丢失。

准确性检测结果：通过146例男性无关个体样本批量检测，各样本均能有效、明确获得目标Y-STR基因座分型，未发现影响结果判读的非特异性峰。与Yfiler试剂盒比对检测，两系统在共有的DYS635、DYS385a/b基因座结果一致，说明24 Y-STR检测体系结果准确可信。

2.2系统基因多样性及与Yfiler系统基因多样性比较

经计算，24 Y-STR检测体系共得到145种单倍型，其中144种单倍型出现1次，1种单倍型出现2次，GD值为0.55（DYS531）～0.96（DYS385a/b），HD值为0.999 72，TGD值为1-1.88×10-14；Yfiler系统共得到143种单倍型，其中141种单倍型出现1次，1种单倍型出现2次，1种单倍型出现3次，单位点GD值为0.36（DYS389）～0.96（DYS385a/b），HD值为0.998 58，TGD值为1-4.97×10-9；24 Y-STR检测体系与Yfiler系统联用共得到145种单倍型，其中144种单倍型出现1次，1种单倍型出现2次，HD值为0.99972，TGD值为1-1.066×10-20。

3　讨论

本研究旨在建立一种针对中国人群的高识别力Y-STR多基因座荧光标记复合扩增体系，作为目前常用商品化试剂盒的补充，以解决在日常Y-STR检验过程中遇到的系统识别力低的难题，为大规模YSTR家系比对数据库的建设提供更多的基因座检测试剂。因此，该系统既要有较高的识别力来满足大样本数据库比对的要求，同时还要性能稳定。验证实验显示，本研究建立的24 Y-STR检测体系种属及性别特异性好、个体同一性好、检测灵敏度高，对血红素、靛蓝、腐殖酸、钙离子、EDTA等常见抑制剂抗干扰性较强，性能稳定，结果可靠，检测峰值均衡，分型易读，操作简单，具有进一步产业化推广应用的基础。

通过对146例男性无关个体的群体遗传学参数的统计结果表明，针对所检测的广东地区人群，本研究选取的24个Y-STR基因座其遗传多样性从整体上要优于Yfiler试剂盒17个Y-STR基因座。24 YSTR检测体系中GD值小于0.7的基因座仅为3个（DYS531、DYS520、Y-GATA-A10）占12.5%，TGD值为1-1.88×10-14，而Yfiler试剂盒所包含的17个Y-STR基因座在相同人群中GD值小于0.7的基因座为10个（DYS439、DYS390、DYS456、DYS389I、DYS19、DYS438、Y-GATA-H4、DYS391、DYS393、DYS437），占58.8%，TGD值为1-4.97×10-9，特别是DYS391、DYS438两个基因座在所统计人群中GD值仅为0.41和0.36，说明本研究建立的Y-STR检测体系所选取的基因座针对所统计人群具有更好的基因多样性，这与本研究的预定目标一致。在相同的人群中本研究建立的24 Y-STR检测体系共获得了145种单倍型，多于Yfiler试剂盒获得的141种单倍型，在人群中具有更高的HD值。总之，本研究建立的24 Y-STR检测体系作为针对中国人群而设计研制的高识别率Y-STR检测系统比目前最常用的商业化Yfiler试剂盒，针对所统计的广东地区男性人群具有更好的基因多样性与识别能力，特别是与Yfiler试剂盒联用时，有效YSTR检测数量可以达到38个，TGD值可以达到1-1.066×10-20，可以应用于法医DNA日常检验，在YSTR数据库建设上应用前景广阔。

参考文献：

［1］王永在，荣辽江，欧拉.法医DNA检验的现状及发展［J］.刑事技术，2005，（2）：28-30.

［2］陈晓辉，李红霞，葛璐璐.应用Y染色体及常染色体STR检验成功串并两宗命案［J］.中国法医学杂志，2007，22（S0）：84.

［3］Tang JP，Hou YP，Li YB，et al.Characterization of eight Y-STR loci and haplotypes in a Chinese Han population［J］.Int J Legal Med，2003，117（5）：263-270.

［4］Dai HL，Wang XD，Li YB，et al.Characterization and haplotype analysis of 10 novel Y-STR loci in Chinese Han population［J］.Forensic Sci Int，2004，145（1）：47-55.

［5］Shi M，Bai R，Yu X，et al.Haplotype diversity of 22 Y-chromosomal STRs in a southeast China population sample（Chaoshan area）［J］.ForensicSciInt Genet，2009，3（2）：e45-e47.

［6］杨电，刘宏，刘超，等.国产磁珠结合自动化工作站批量提取生物检材DNA的应用［J］.中国法医学杂志，2009，24（6）：404-406.

（本文编辑：李成涛）

中图分类号：DF795.2

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.005

文章编号：1004-5619（2016）03-0180-04

基金项目：广东省法医遗传学重点实验室资助项目（2010A06 0801001）；广东省科技计划资助项目（2013B021500010）

作者简介：刘宏（1979—），男，硕士，副主任法医师，主要从事法医DNA检验和研究；E-mail：79liuhong@163.com

通信作者：刘超，男，博士，主任法医师，博士研究生导师，主要从事法医遗传学研究；E-mail：liuchaogzf@163.com实际应用中有局限性，特别是近年随着Y-STR技术的拓展应用，在很多案件中Y-STR数据被用来进行群体和家系排查，现有Y-STR检测系统识别力不能满足实际应用需求，也成为建立大区域Y-STR数据库的瓶颈。因此，研发一种针对中国人群的高识别力Y-STR检测新体系十分必要。本研究根据近年国内外的相关报道［5］选取在中国人群中多样性较高，且等位基因片段长度差距小的DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a/b、DYS460、YGATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570、DYS385a/b和DYS444共24个基因座建立复合扩增检测系统（简称24 Y-STR检测体系），其中DYS385a/b、DYS527a/b与DYS459a/b为双拷贝基因座，上述基因座中未包括在现有商品试剂盒体系内的基因座有21个，与Yfiler试剂盒体系相同的基因座有3个（DYS635、DYS385a/b）。

收稿日期：（2015-04-03）

Development of a Fluorescence Multiplex Amplification System with 24 Y-STR Loci

LIU Hong1，LI Yue1，LIU Chang-hui1，LIU Chao1，GE Bin-wen2，CHEN Lin-li2
（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Forensic Genetics，Guangzhou Institute of Forensic Science，Guangzhou 510030，China；2.AGCU ScienTech Incorporation，Wuxi 214174，China）

Abstract：Objective To establish a novel multiplex amplification system which comprises 24 Y-STR loci.Methods Total 24 Y-STR gene loci，concluding DYS531，DYS630，DYS622，DYS552，DYS510，DYS449，DYS459a/b，DYS446，DYS443，DYS635，DYS587，DYS527a/b，DYS460，Y-GATA-A10，DYS520，DYS557，DYS522，DYS481，DYS570，DYS385a/b，DYS444，were chosen for establishing the fluorescence multiplex amplification system.The specificity，identity，sensitivity，balance of the amplification，anti-interference and accuracy of the system were detected and the gene diversity was investigated in the population of Guangdong.Results No band was found in nonhuman and female samples that were tested by the established multiplex amplification system.The same genotyping results were obtained from different tissues of the same person.Complete profiles could be obtained from more than 0.1 ng of the standard sample 9948.The loss of alleles was found when the common inhibitors such as hemoglobin and calcium ion were added 120-200μmol/L and 1.5-2.0mmol/L respectively to the system which with a strong anti-interference to the indigo，humic acid and EDTA.The typing of 24 Y-STR system could give the reliable results when 146 unrelated male individuals were detected and compared with the Yfiler system parallelly.The haplotype diversity（HD）of the population in Guangdong reached 0.999 72 that was better than the result retained from Yfiler system，which the HD was 0.998 58.Conclusion The fluorescence amplification system with 24 Y-STR loci established in present study has a wildly application prospect and can be used for cases inspection，paternity tests and Y-STR database construction.

Key words：forensic genetics；Y chromatosome；tandem repeat sequences；fluorescent multiplex amplification