5种甘肃道地中药对衰老小鼠免疫功能影响的比较研究

王 昱

（陇南师范高等专科学校生化系，甘肃 成县 742500）



5种甘肃道地中药对衰老小鼠免疫功能影响的比较研究

王 昱

（陇南师范高等专科学校生化系，甘肃 成县 742500）

［摘 要］目的：研究5种甘肃道地中药对衰老小鼠免疫功能影响的差异。方法：将70只健康小鼠随机分成正常组、模型组、纹党组、红芪组、当归组、大黄组和半夏组，采用D-半乳糖建立亚急性衰老小鼠模型，检测每组小鼠的脾脏和胸腺指数，血IL-1、IL-2、IL-4含量及T淋巴细胞亚群，T淋巴细胞增殖能力，脾胸腺超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量。结果：与正常组相比，模型组小鼠脾脏和胸腺指数，血IL-1、IL-2、IL-4、CD4+T细胞和CD4+/CD8+T细胞比值，脾T淋巴细胞增殖能力，脾和胸腺SOD、GSH-Px活性均显著降低，MDA含量显著升高（p<0.05，p<0.01）。与模型组比较，各中药组小鼠脾脏和胸腺指数，血IL-1、IL-2、IL-4、CD4+T细胞和CD4+/CD8+T细胞比值，脾T淋巴细胞增殖能力，脾和胸腺SOD、GSH-Px活性均呈增高趋势，MDA含量均呈降低趋势，纹党组和红芪组上述指标改变更为明显。结论：纹党和红芪水提物对衰老小鼠某些免疫功能的调节作用优于当归、大黄和半夏。

［关键词］道地中药；衰老；免疫；小鼠

衰老是生命过程中不可抗拒的自然规律。随着我国老年人口比重的增加和老年性相关疾病的增多，衰老与延缓衰老已经逐步成为我国重大的公共卫生问题［1］。研究认为，免疫功能的衰退是造成机体衰老的重要原因，免疫系统从根本上参与了机体的衰老过程［2］。中医药独特的理论体系为人们提供了一条有别于其他药物防治衰老的新治疗途径。由于中药具有活性成分多、作用靶点多、给药途径多、不良反应小等特点，使其具有独特优势，在抗衰老的研究中显示出巨大的优势和潜力，其药理学功能有延缓衰老、抗氧化、调节体液免疫、促进淋巴细胞增殖、影响免疫器官的质量和单核巨噬细胞的功能等［3-4］。

甘肃省陇南地区有许多优质的道地中药材，其中以文县的纹党、武都的红芪、宕昌的当归、礼县的大黄和西和的半夏最为驰名。已有文献报道，纹党、红芪、当归、大黄和半夏有延缓衰老、抗氧化、抗病毒和提高机体免疫力等功能［5-9］。本研究制备了D-半乳糖致衰老小鼠模型，分析比较纹党、红芪、当归、大黄和半夏对衰老小鼠免疫功能影响的差异，为进一步指导临床合理用药奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

甘肃武都产红芪、宕昌产当归、文县产纹党、礼县产大黄、西和产半夏（由甘肃农业大学李唯教授鉴定）；D-半乳糖（北京优尼康生物科技）；刀豆蛋白A（ConA）和四甲基偶氮唑盐（MTT）（美国Sigma公司）；DMSO（上海碧云天生物技术公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）（南京建成生物工程研究所）；小鼠白细胞介素1（IL-1β）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程研究所）；二氧化碳培养箱（日本 Sanyo公司）；PC5标记的抗大鼠CD3抗体、FTTC标记的抗大鼠CD4抗体、PE标记的抗大鼠 CD8抗体（均为Biolegend公司）。FACS420型流式细胞仪（美国BD公司生产），U-1800型UV-VIS全自动分光光度计（日本 Tokyo），SpectraMaxM5型酶标仪（Molecular Devices，美国），高速台式冷冻离心机（TGL-16M，美国Beckman）等；70只清洁级昆明小鼠（兰州大学实验动物中心，生产许可证编号: SCXK（甘）2009-0004），体质量18～20 g，雌雄各半。

1.2方法

1.2.1中药水煎剂溶液的制备

称取中药50 g置砂锅中，加10倍量水浸泡过夜，加热至沸，改用文火煎30 min，趁热滤过，滤渣另加8倍量水，同法煎煮30 min、滤过，合并2次滤液于烧杯中［10］，水浴浓缩后放凉至室温，100 mL容量瓶定容，倒入输液瓶中，盖薄膜，压胶塞和铝盖，高压灭菌（表压0.7 kg·cm-2、115℃、30 min），取出放凉稀释为1 g·kg-1溶液备用。

1.2.2动物模型建立与给药

健康昆明小鼠70只，同条件饲养，喂食普通固体饲料，自由饮水。随机分正常组、模型组、红芪组、当归组、纹党组、大黄组和半夏组，每组10只。除正常组外，其余各组动物颈背部皮下注射10% D-半乳糖（10 mL·kg-1），每天1次，连续注射14 d，于第15 d天开始（每天继续注射D-半乳糖），红芪组、当归组、纹党组、大黄组和半夏组每天灌胃药物治疗，给药容积10 mL·kg-1，正常组和模型组每天灌胃等体积的生理盐水，每天1次，各组连续给药和造模32 d。

1.2.3计算脾脏指数和胸腺指数

于末次给药的次日，每组小鼠称体质量后，颈椎脱臼处死各组小鼠，取小鼠的脾脏和胸腺，用生理盐水洗净，吸干生理盐水，称质量。脏器指数（mg·g-1）=脏器湿重（mg）/小鼠体质量（g）。

1.2.4 血清IL-1、IL-2、IL-4含量的测定

动脉采血，离心 10 min（3 000 r·min-1），取上清液，按照检测试剂盒说明书操作，检测小鼠血清中IL-1、IL-2、IL-4含量。

1.2.5外周血T淋巴细胞亚群分析

动脉采血，加入EDTA钠盐抗凝管中，用荧光团标记的单克隆抗体试剂与100 μL全血混匀，室温避光孵育15 min。经溶血仪处理后，采用流式细胞仪检测分析T淋巴细胞百分率。

1.2.6脾T淋巴细胞增殖反应测定

处死动物后无菌取脾，置于盛有适量淋巴细胞分层液的平皿，洗去血迹，剪去筋膜组织，研碎脾脏，200目细胞筛网过滤，Hank’s液洗涤两次，重新悬浮，调整细胞密度为1×107/mL。将细胞悬液加入96孔培养板，每孔100 μL，每个样本设8个复孔，其中4孔每孔加100 μL Con A（终浓度为5 mg·L-1），另外4孔作为对照，于37℃ 5%CO2饱和湿度条件下培养68 h，每孔加10 μL MTT（浓度为5 g·L-1），在振荡器上振荡混匀，继续培养4 h。细胞培养终止后，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，振荡混匀，静置数分钟，测定每孔的 OD492 nm值。

1.2.7脾脏胸腺抗氧化能力的测定

取小鼠脾脏、胸腺组织，洗净，冰浴匀浆，离心10 min（3 000 r·min-1），取上清液，按照试剂盒操作步骤测定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.2.8数据处理

所有数据以¯x±s表示，用SPSS13.0软件进行单因素方差分析，LSD法进行组间两两比较，以p< 0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1小鼠脏器指数比较

模型组小鼠脾脏指数和胸腺指数比正常组均降低（p<0.05），纹党组小鼠脾脏指数和胸腺指数比模型组脾脏指数和胸腺指数显著升高（p< 0.05），其余各给药组间小鼠脾脏指数和胸腺指数与模型组相比，无明显变化（p>0.05，如表1所示）。

2.2小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量的比较

与正常组相比，模型组小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量显著降低（p<0.05，p<0.01）。与模型组相比，各给药组小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量均呈升高趋势，但纹党组和红芪组小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量显著高于模型组（p<0.05，p<0.01），且纹党组小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量高于红芪组（p< 0.05），其余各给药组间小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量与模型组相比，无显著差异（p>0.05，如表2所示）。

表1　5种中药对脾脏指数和胸腺指数的影响Table 1 Effects of five kinds of Chinese herbs on spleen and thymus gland index（mg·g-1）

表2　5种中药对血清IL-1、IL-2、IL-4含量的影响Table 2 Effects of five kinds of Chinese herbs on levels of serum IL-1，IL-2 and IL-4（ng·L-1）

2.3小鼠脾T淋巴细胞增殖能力比较

与正常组相比，模型组小鼠脾T淋巴细胞增殖能力显著降低（p<0.01）。与模型组相比，纹党组、红芪组和当归组小鼠脾T淋巴细胞增殖能力显著高于模型组（p<0.05，p<0.01），纹党组小鼠脾T淋巴细胞增殖能力高于红芪组和当归组（p< 0.05），红芪组小鼠脾T淋巴细胞增殖能力与当归组间无显著差异（p>0.05），大黄组和半夏组小鼠脾T淋巴细胞增殖能力与模型组相比，无显著差异（p>0.05，如图1所示）。

2.4外周血T淋巴细胞亚群的比较

与正常组比较，模型组小鼠 CD4+T细胞、CD8+T细胞及CD4+/CD8+T细胞比值明显降低（p <0.05，p<0.01）。各给药组与模型组比较，纹党组和红芪组CD4+T细胞及CD4+/CD8+T细胞比值增加明显（p<0.05），CD8+T细胞无明显变化（p >0.05），纹党组和红芪组间无显著差异（p> 0.05），其他各组 CD4+T细胞、CD8+T细胞及CD4+/CD8+T细胞比值均无明显变化（p>0.05，如表3所示）。

表3　5种中药对外周血T淋巴细胞亚群的影响Table 3 Effect of five kinds of Chinese herbs on peripheral blood T lymphocyte subsets

2.5小鼠脾脏和胸腺SOD、GSH-Px、MDA比较

与正常组相比，模型组小鼠脾脏和胸腺SOD、GSH-Px活性显著降低，MDA含量显著增加（p< 0.01）。与模型组相比，各给药组小鼠脾脏和胸腺SOD、GSH-Px活性均有升高趋势，MDA均有降低趋势，其中纹党组、红芪组和当归组小鼠脾脏和胸腺SOD、GSH-Px、MDA与模型组差异极显著（p< 0.01），纹党组、红芪组和当归组间均无差异（p> 0.05）；大黄组和半夏组小鼠脾脏和胸腺 SOD、GSH-Px、MDA与模型组差异显著（p<0.05），大黄组和半夏组间无显著性差异（p>0.05，如表4所示）。

3　讨论

衰老是机体的生理功能逐渐下降，组织器官逐步发生退行性改变，并最终走向死亡的过程。免疫学说认为，免疫组织和免疫器官的功能状态与衰老的发生与发展密切相关，机体免疫功能失调，可诱发严重的疾病，加剧细胞、组织和器官的衰老过程［2］。据文献报道，纹党［5］、红芪［6］、当归［7］、大黄［8］、半夏［9］及其有效提取物均可以通过调节机体体液免疫、细胞免疫和抗氧化等，来达到增强机体免疫功能的能力。为了更好地区别纹党、红芪、当归、大黄和半夏的药理作用，实验从免疫系统相关指标着手，综合比较纹党、红芪、当归、大黄和半夏水提物对衰老小鼠免疫功能的影响。

表4　5种中药对脾脏和胸腺SOD、GSH-Px、MDA的影响Table 4 Effect of five kinds of Chinese herbs on levels of SOD，GSH-Px and MDA in spleen and thymus gland

脾脏是人体最大的免疫器官，含有大量的淋巴细胞和巨嗜细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心，同时也是重要的造血器官。胸腺是机体的中枢免疫器官，能产生淋巴细胞，并运送到淋巴结和脾脏等处［5］。所以，脾脏、胸腺指数是反应机体免疫功能的重要指标。本实验结果显示，与正常组比较，模型组小鼠的脾脏、胸腺指数显著降低；与模型组比较，纹党组小鼠两器官指数显著升高，而其余各给药组小鼠两器官指数与模型组相比差异不显著，表明纹党对衰老小鼠重要脏器脾脏、胸腺具有较好的保护作用，与其他单一性抗衰老药物相比，体现了纹党抑制衰老的优越性。

IL-1主要由活化的单核-巨噬细胞产生，能促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖分化，增强NK细胞的杀伤活性，也可以诱导其他多种细胞因子的分泌［11］。IL-2主要由T细胞产生，以自分泌和旁分泌方式发挥效应，是机体免疫调节网络中的核心物质，能够活化T细胞、刺激NK细胞增殖、增强NK杀伤活性及产生细胞因子、促进B细胞增殖和分泌抗体、激活巨噬细胞等。IL-4主要由 CD4+T细胞产生，主要作用于B细胞、T细胞、巨噬细胞、NK细胞等4种靶细胞，具有重要的免疫调节作用［12］。T淋巴细胞产生的免疫应答为细胞免疫，一方面它可以与靶细胞特异性结合，直接杀伤靶细胞，另一方面它可以直接释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强，故T淋巴细胞增殖能力的强弱，可以反映机体细胞免疫功能的高低［13］。本实验结果显示，与正常组相比，模型组小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量及脾T淋巴细胞增殖能力显著降低，这与文献［12-13］报道一致。与模型组相比，各给药组小鼠血清IL-1、IL-2、IL-4含量及脾T淋巴细胞增殖能力均呈升高趋势，其中纹党和红芪效果更为明显，表明纹党和红芪在提高衰老小鼠机体特异性免疫和非特异性免疫方面高于其他几种中药。

CD4+T细胞和CD8+T细胞是鉴定T细胞亚群的重要表面标志。CD4+T细胞协助B细胞进行分化和产生抗体，CD8+T细胞主要是具有杀伤和抑制作用，CD4+/CD8+T细胞比值能够作为初步评估机体免疫系统是否维持在一个平衡状态的重要指标，其值下降表示免疫状态受抑制［14］。所以，在抗衰老药物的治疗结果检测中，常以T淋巴细胞的变化作为重要的参考指标。本研究结果显示，模型组小鼠 CD4+T细胞、CD8+T细胞及 CD4+/ CD8+T细胞比值明显低于正常组，提示D-半乳糖可造成机体细胞免疫功能受损。与模型组比较，灌服纹党和红芪均可显著增加衰老小鼠外周血CD4+T细胞及CD4+/CD8+T细胞比值，而CD8+T细胞无显著性差异，表明纹党和红芪在维持CD4+T细胞比例的相对平衡状态方面，具有一定疗效，但这种作用的分子机制还有待于进一步研究。

SOD和GSH-Px是动物机体内重要的抗氧化剂，MDA是自由基和脂质过氧化的代谢终产物。因此，检测组织中SOD及GSH-Px活性以及MDA含量，可以了解组织过氧化损伤的程度［15］。本实验发现，模型组小鼠脾脏和胸腺SOD、GSH-Px的活性均显著低于正常组，MDA的含量显著增加，经纹党、红芪、当归、大黄和半夏灌胃处理后小鼠脾脏和胸腺SOD、GSH-Px的活性均显著升高，MDA的含量显著降低，与模型比较均有统计学意义，其中纹党组、红芪组和当归组小鼠脾脏和胸腺SOD、GSHPx、MDA与模型组间差异极显著，表明这5种道地中药在抗脂质过氧化和清除氧自由基的作用方面具有相似的功能，而纹党、红芪、当归在提高机体抗氧化能力方面高于大黄和半夏。

综上所述，纹党、红芪等水煎液对衰老小鼠免疫系统均有不同程度的调整作用，尤以纹党、红芪作用为甚。这种作用可能与免疫器官抗氧化酶活性、T淋巴细胞增殖力、T细胞亚群和细胞因子IL-1、IL-2、IL-4分泌等变化有关。据此，在治疗临床免疫相关疾病、延缓机体的衰老进程时可以优选纹党和红芪，也为道地中药复方的开发提供了实验依据。

［参考文献］

［1］ 雷超，张力华，苏婷.加味四君子汤对衰老大鼠的脾脏及细胞因子的影响［J］.中华中医药杂志，2014，29（9）:2941 -2944.

［2］ Weiskopf D，Weinberger B，Grubeck-Loebenstein B.The aging of the immune system［J］.Transpl Int，2009，22（11）: 1041-1050.

［3］ Zhang W，Li R，Wang S，et al.Effect of Chinese traditional herb Epimedium grandiflorum C.Morren and its extract Icariin on osteoarthritis via suppressing NF-kappaB pathway［J］.Indian J Exp Biol，2013，51（4）:313-321.

［4］ Xie S，Ling X L.Regulation effects of Auricular Acupuncture，Moxibustion and Chinese herbs on immunologic function in the D-galactose-induced aging mouse［J］.J Tradit Chin Med，2008，28（2）:129-133.

［5］ 何敏，伍春，明海霞，等.甘肃党参水煎剂对D-半乳糖诱导衰老小鼠免疫功能的影响［J］.细胞与分子免疫学杂志，2013，29（8）:794-797.

［6］ 蔺兴遥，张毅，李娟，等.黄芪黄酮与红芪黄酮对肺间质纤维化模型大鼠肺功能影响的对比研究［J］.中成药，2013，35（8）:1770-1773.

［7］ 张梦思，邹婷，叶渊文，等.当归多糖对衰老模型大鼠脾脏结构与功能的影响［J］.解剖学报，2015，22（2）:310-311.

［8］ Lin C C，Lee M H，Lin J H，et al.Crude extract of Rheum palmatum L.Induces cell cycle arrest S phase and apoptosis through mitochondrial-dependent pathways in U-2 OS human osteosarcoma cells［J］.Environ Toxicol，2015，30（2）:1-13.

［9］ Xu T，Wang B，Wang L，et al.Pinellia ternata agglutinin produced in Bombyx mori cells exhibits bioactivity［J］.Acta Biochim Pol，2012，59（2）:231-236.

［10］ 王璟.如何煎制中药汤剂［J］.首都医药，2000，7（2）:55.

［11］ Cho S H，Chen J A，Sayed F，et al.SIRT1 deficiency in microglia contributes to cognitive decline in aging and neurodegeneration via epigenetic regulation of IL-1β［J］.J Neurosci，2015，35（2）:807-818.

［12］ 胡燕，程卫东，刘欣，等.红芪和黄芪水提物对小鼠免疫功能影响的差异［J］.北京中医药大学学报，2011，34（9）: 623-626.

［13］ 桂曼曼，张李峰，李雪嫣，等.同一复方用黄芪与用红芪对小鼠免疫功能影响的比较研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（21）:203-206.

［14］ Tatari-Calderone1 Z，Stojakovic M，Dewan R，et al.Age-related accumulation of T cells with markers of relatively stronger autoreactivity leads to functional erosion of T cells［J］.BMC Immunology，2012，13（8）:1471-1482.

［15］ Palmer D M，Kitchin J S.Oxidative damage，skin aging，antioxidants and a novel antioxidant rating system［J］.J Drugs Dermatol，2010，9（1）:11-15.

（责任编辑 柴 智）

Comparative Study on the Immune Function of Five Kinds of Gansu Authentic Chinese Herbal Medicines in Aging Mice

WANG Yu
（Department of Biology and Chemistry，Longnan Teachers College，Chengxian Gansu 742500，China）

Abstract:The objective of this research is to study the different influences of five kinds of Gansu authentic Chinese herbal medicines on the immune function in aging mice.Seventy mice were randomly divided into normal control group，model group，Codonopsis pilosula group，Astragali radix group，Angelica sinensis group，Rheum palmatum L group and Pinellia ternate group.Aging mice models were made by D-galactose.The indexes of spleen and thymus gland，the levels of serum interleukin-1β（IL-1），interleukin-2（IL-2），interleukin-4（IL-4），T lymphocyte subsets，proliferation of T cells，and the activities of superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）and the content of malondialdehyde（MDA）in spleen and thymus gland were detected. Compared with normal control group，the indexes of spleen and thymus gland，the levels of serum IL-1，IL-2，IL-4，T lymphocyte subsets（CD4+and CD4+/CD8+），proliferation of T cells，and the activities of SOD，GSH-Px in spleen and thymus gland were markedly reduced in aging model group，the content of MDA was markedlyincreased（p<0.05，p<0.01）.Compared with model group，the indexes of spleen and thymus gland，the levels of serum IL-1，IL-2，IL-4，T lymphocyte subsets（CD4+and CD4+/CD8+），proliferation of T cells，and the activities of SOD，GSH-Px in spleen and thymus gland showed increasing trend，MDA content tended to decrease in herb groups（p<0.05，p<0.01）.These above indexes became more significant in the Codonopsis pilosula group and Astragali radix group.The results showed that the aqueous extracts of Codonopsis pilosula and Astragali radix have better regulation effects on the immune function in aging mice than those of Angelica sinensis，Rheum palmatum L and Pinellia ternata.

Key words:Authentic Chinese herbs；Aging；Immunity；Mouse

［中图分类号］R 285.5

［文献标志码］A

［文章编号］1005-0310（2016）02-0077-06

DOI：10.16255/j.cnki.ldxbz.2016.02.014

［收稿日期］2015-11-07

［基金项目］甘肃省自然科学基金项目（1107RJZK243），甘肃省高等学校科研资助项目（2015B-148）。

［作者简介］王昱（1973-），男，甘肃省天水市人，陇南师范高等专科学校教授，研究方向为细胞与发育生物学。E-mail:gswangyu@126.com