磁性固相萃取–液质联用测定环境水体中喹诺酮类抗生素

成　婧，付善良，丁　利，徐瑞丽，朱绍华，龚　强，王利兵

（湖南出入境检验检疫局技术中心/食品安全科学技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004）



磁性固相萃取–液质联用测定环境水体中喹诺酮类抗生素

成婧，付善良，丁利，徐瑞丽，朱绍华，龚强，王利兵*

（湖南出入境检验检疫局技术中心/食品安全科学技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004）

摘 要：建立了一种联合高效液相色谱–三重四级杆质谱法检测环境水体中15种喹诺酮类抗生素的方法。该方法以Fe3O4磁性石墨烯为固相萃取吸附剂，以喹诺酮类抗生素的回收率为检测指标。对该方法中洗脱剂、萃取剂用量、萃取时间等主要参数进行优化后得到的较优试验条件为：以10％氨水甲醇为洗脱剂，磁性石墨烯用量为30 mg，萃取吸附时间为30 min。在优化条件下，15种喹诺酮类抗生素的检出限为6.5 ～12.8 ng/L，在10～500 ng/L范围内线性关系良好（R为0.999 1～0.999 8）。利用该方法分别对自来水样、养殖水样以及医疗废水样进行分析测定，3种实际样品的加标回收率为70.0％～90.7％，相对标准偏差均小于10％。

关 键 词：喹诺酮类抗生素；环境水体；Fe3O4；磁性石墨烯；液相色谱–三重四级杆质谱法；固相萃取

投稿网址：http://xb.ijournal.cn

养殖用水、饮用水源以及其他环境水体中抗生素的污染已备受关注［1–2］。以喹诺酮类药物为代表的抗生素在临床医疗中被滥用，可能使人体产生耐药性，在动物养殖过程中不规范使用也会带来动物源食品的质量安全问题。这些药物以原药、粪便、尿液等各种形式进入环境水体后还会增加环境安全和生态健康的风险［3–5］。

喹诺酮类药物的检测分析方法很多［6］，高效液相色谱法因其分离效率高，稳定性好，在药物质量控制、血样分析、食品检测、环境监测等方面得到了广泛应用［7–9］。该方法与质谱技术联用对于检测复杂基质中多种喹诺酮类抗生素具有明显优势［10–13］。由于环境水体中喹诺酮类抗生素的含量一般较低，常需要用固相萃取柱对其进行富集和分离［8，14］。这些方法存在成本高、有机试剂污染大等缺陷。

作为一种新型碳纳米材料，磁性石墨烯具有比表面大、吸附性能好、分离便利、环境友好等特点［15–19］。本研究中以Fe3O4磁性石墨烯作为固相萃取剂对喹诺酮类抗生素进行富集和分离，结合 HPLC–MS/MS技术对环境水体中15种喹诺酮类抗生素进行检测分析，旨在为环境水体中喹诺酮类抗生素的分析提供简便、灵敏的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

Fe3O4磁性石墨烯（XF018，黑色粉末状固体）购自南京先丰纳米材料科技有限公司。

主要仪器：Agilent 1260–6490高效液相色谱–三重四级杆质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；ZHWY–200D多振幅高速轨道摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；PB203–N电子天平（上海梅特勒–托利多仪器有限公司）。

主要试剂：依诺沙星、麻保沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、丹诺沙星、洛美沙星、恩诺沙星、奥比沙星、沙拉沙星、司帕沙星、二氟沙星、噁喹酸、氟甲喹等 15种标准品均购自Dr. S. Enernstorfer公司，纯度均大于99.0％；丙酮、乙腈、甲醇为HPLC级，美国Tedia公司产品；乙酸、盐酸、氨水为分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品；试验用水为 Mili–Q 超级水系统（Milipore，美国）纯化的纯净水。

1.2 标准溶液的配制及样品前处理

将 15种喹诺酮类标准品用乙腈配制成 1.0 mg/mL的单标储备液，4 ℃下避光保存。将单标储备液用乙腈配制成试验所需浓度的混标中间液。根据需要，用基质空白溶液将混标中间液稀释，配制成试验所需浓度的混标工作液。

自来水样直接取自笔者所在的实验室；养殖水样取自湘北某蟹类养殖基地的养殖水域；医疗废水样取自长沙市某三甲医院附近的污水管道。水样用棕色瓶放置于4 ℃冰箱中，过0.45 μm水相膜后直接使用。

取50 mL水样于离心管中，用稀盐酸调节pH值至4.0，加入30 mg磁性石墨烯后盖上盖子，于摇床中振荡吸附30 min，用磁铁将磁性石墨烯吸至离心管底部侧壁，取出水液。往离心管中再次加入1 mL 10％氨水甲醇溶液，盖上盖子漩涡提取1 min，用磁铁重复以上操作，取出洗脱液于玻璃小管中。重复以上洗脱过程2次。合并洗脱液，用40 ℃氮气吹干，准确加入1 mL 0.1％乙酸乙腈重新溶解，过0.45 μm滤膜后进样分析。

1.3 液相色谱条件和质谱条件

液相色谱柱为 Agilent Eclipse AAA柱（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）。流动相为0.1％乙酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脱程序如下：0～3.5 min 85％A～45％A；3.5～6.5 min 45％A；6.5～7.5 min 45％A ～85％A；7.5～11.5 min 85％A。流速0.5 mL/min。柱温40 ℃。进样量10 μL。

离子源为电喷雾离子源（ESI）。正离子扫描模式。检测方式为多反应监测（MRM）。雾化气压力（氮气）20 Psi。干燥气温度320 ℃，流速14 L/min。鞘气温度300 ℃，流速11 L/min。毛细管电压3 000 V。喷嘴电压1 500 V。15种喹诺酮类抗生素的驻留时间均为10 ms，脆裂电压均为380 V，加速电压均为4 V，其定性/定量离子对、碰撞能量见表1。

表1　15种喹诺酮类抗生素的质谱参数Table 1 LC–MS/MS parameters of 15 quinolone antibiotics

1.4 测定方法优化

1.4.1 萃取条件的优化

为了达到较佳的萃取富集效果，采用空白加标方法依次对洗脱剂种类及其用量、萃取剂用量、萃取时间等条件进行考察，重复3次，结果取3次的平均值。在优化萃取条件的过程中，以喹诺酮类抗生素回收率来衡量磁性石墨烯颗粒的萃取效率。R=V0C0/VC，其中，R为哇诺酮类抗生素回收率（％）；V0为重新定容体积（mL）；C0为进样浓度；V为待测水样体积；C为待测浓度。

首先考察甲醇、乙腈、丙酮、氨水甲醇4种常用洗脱剂对磁性石墨烯上喹诺酮类抗生素的洗脱效果，然后在最佳洗脱条件下考察磁性石墨烯用量对喹诺酮类抗生素萃取效率的影响，最后确定磁性石墨烯对喹诺酮类抗生素吸附的较佳平衡时间。

1.4.2 方法确证

在已优化的试验条件下分别对质量浓度 10、50、100、200、500 ng/L的诺酮类抗生素标准工作液进行测定，将目标分析物的峰面积和相应的浓度进行线性回归，考察其线性范围、线性相关系数、最低检出限、相对标准偏差等参数。

1.4.3 方法应用

按照已建立的检测方法分别测定自来水样、养殖水样和医疗废水样中的喹诺酮类抗生素的含量，同时对以上3种样品以15、100 ng/L 的加标水平进行喹诺酮类抗生素质量浓度测定。每个水平分别进行5次平行测定。

2 结果与分析

2.1 磁性石墨烯颗粒的SEM表征

试验中所用Fe3O4磁性石墨烯的电镜扫描结果见图1。由图1–A可见，石墨烯的多层薄片结构清晰，Fe3O4在石墨烯表层附着均匀，即便是经过较长时间的超声或振荡操作，Fe3O4仍能在石墨烯薄片上紧密吸附。该颗粒在水中具有良好的分散性（图1–B）；在外加磁场的作用下能很好地吸附在离心管或玻璃小瓶内壁（图1–C）。

图1　Fe3O4磁性石墨烯的电镜扫描结果（A）、在水中的分散性状态（B）及其在磁场作用下的效果（C）Fig.1 SEM image of the Fe3O4MNP@G （A）， dispersible behavior photographs of Fe3O4MNP@G in water （B） and separation phenomenon in magnetic field （C）

2.2 洗脱条件的优化结果

2.2.1 适宜洗脱剂的选取

由图2可见，4种洗脱剂中，氨水甲醇的洗脱效果明显比其他3种的好。考虑到操作的可行性，选取10％的氨水甲醇为适宜洗脱剂。

图2　不同洗脱剂下15种喹诺酮类抗生素的洗脱回收率Fig.2 Recovery of 15 quinolone antibiotics at different elution solution

2.2.2 适宜磁性石墨烯用量的确定

由图3可见，在磁性石墨烯用量为10～30 mg时，所有喹诺酮类抗生素的回收率随着萃取剂用量的增加而增加，当萃取剂用量多于30 mg后，目标分析物的回收率并无明显增加，因此，选取30 mg作为磁性石墨烯的适宜用量。

图3　不同萃取剂用量下15种喹诺酮类抗生素的回收率Fig.3 Recovery of 15 quinolone antibiotics at different dosage of Fe3O4MNP@G

2.2.3 适宜萃取时间的选取

如图4所示，当平衡时间由5 min逐渐增加到30 min时，喹诺酮类抗生素的回收率达到最大，此时水样中喹诺酮类抗生素的残留量极少，目标待测物已经基本被磁性石墨烯吸附完全，所以，认为适宜萃取时间为30 min。

图4　不同萃取时间下15种喹诺酮类抗生素的回收率Fig.4 Recovery of 15 quinolone antibiotics at different extraction time

2.2.4 适宜水样pH值的选取

用氢氧化钠和盐酸将水样的pH值调为4.0，此时目标喹诺酮类抗生素的回收率均较高，所以，认为水样pH值以4.0较为适宜。

2.3 方法确证

表2结果表明，除二氟沙星、依诺沙星的线性范围为15～500 ng/L之外，其他喹诺酮类抗生素的线性范围均为10～500 ng/L，15种喹诺酮类抗生素的检出限为6.5～12.8 ng/L，线性相关系数为0.999 1～0.999 8，相对标准偏差为1.9％～7.3％。15种喹诺酮类目标分析物的总离子流图见图5。

表2　15种喹诺酮类抗生素的线性范围、相关系数、方法的检出限和相对标准偏差（n=5）Table 2 Linear range， correlation coefficients， LOD and RSD for the 15 quinolone antibiotics（n=5）

图5　15种喹诺酮类抗生素的离子对色谱图Fig.5 Chromatogram of extracted ions from15 quinolone standards

2.4 方法应用

自来水样、养殖水样及医疗废水样中喹诺酮类抗生素含量的测定结果及其15、100 ng/L共2个水平的加标检测结果的平均回收率及精密度见表3。

表3　实际水样中15种喹诺酮类抗生素的含量和添加回收率及精密度（n=5）Table 3 Detection results on concentration， fortified recovery and RSD of the 15 quinolone antibiotics in three type water samples（n=5）

由表3可知，在自来水样中未检出喹诺酮类药物，在养殖水样中检出了环丙沙星（45.2 ng/L），在医疗废水样中检出了氧氟沙星（115.4 ng/L）、环丙沙星（53.3 ng/L）、诺氟沙星（48.4 ng/L）。从加标回收结果来看，15种喹诺酮类抗生素的平均回收率为70.0％～90.7％，精密度为 1.9％～7.1％，说明该方法具有较好的回收率和重现性。

3 结论与讨论

采用联合高效液相色谱–三重四级杆质谱法同时测定环境水体中 15种喹诺酮类抗生素，水样用磁性 Fe3O4石墨烯颗粒为固相萃取吸附剂直接萃取，再以10％氨水甲醇为洗脱剂洗脱。在优化条件下15种喹诺酮类抗生素的检出限为6.5 ～12.8 ng/L，在10 ～500 ng/L线性关系良好。该方法能够用于对自来水样、养殖水样以及医疗废水样等实际样品中多种喹诺酮类抗生素的含量进行测定，且操作简便，环境友好，灵敏度高，可以为环境监测提供可靠的技术支撑。

环丙沙星是水产品养殖中已被批准使用的常用抗生素之一，已在蟹类养殖中得到应用。由本试验结果可知，在此类抗生素的应用中，除了需要密切关注其原药及其所养殖水产品的代谢物造成的水环境污染之外，还需密切关注水产品中此类抗生素代谢不全带来的动物源食品的兽药残留隐患。本研究中在医疗废水中检出了氧氟沙星、环丙沙星和诺氟沙星，表明这3种常用的喹诺酮类抗菌药在使用后可能通过医疗废弃物以及人体代谢等渠道进入水环境中，因此，需要特别留意以此为代表的抗生素等高浓度药物带来的水环境污染问题。

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责任编辑：王赛群

英文编辑：王 库

Determination of quinolone antibiotics in water by magnetic solid phase extraction and HPLC–MS

Cheng Jing，Fu Shanliang，Ding Li，Xu Ruili，Zhu Shaohua，Gong Qiang，Wang Libing*
（Hunan Academy of Inspection and Quarantine， Technology Center of Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau/ Hunan Key Laboratory of Food Safety Science &Technology， Changsha 410004， China）

Abstract:Based on solid phase extraction （SPE） with Fe3O4magnetic nanocomposite @ graphene （MNP@G） as adsorbent， an approach was developed for determination 15 quinolone antibiotics in water by high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry （HPLC–MS）. The main factors affecting the extraction efficiency were investigated. The optimized extraction conditions were: 10％ ammonia in methanol （V/V） as elution solution， 30 mg MNP@G as adsorbent， 30 min adsorption time. Under the conditions， the detection limit of 15 quinolone antibiotics were from 6.5 to 12.8 ng/L， the calibration curves showed good linearity （r =0.999 1～0.999 8） with the concentration range from 10 to 500 ng/L. The developed approach was perfectly applied in the analysis of tap water， agricultural and medical wastewater. The recoveries ranged from 70.0％ to 90.7％ for the 3 real spiked samples， and the relative standard deviations were all less than 10％.

Keywords:quinolone antibiotics； environmental water body； Fe3O4； magnetic nanocomposite@graphene； high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry （HPLC–MS）； solid phase extraction

中图分类号：X131.2

文献标志码：A

文章编号：1007−1032（2016）03−0328−04

收稿日期：2015–10–27 修回日期：2016–03–07

基金项目：国家“863”计划项目（2012AA06A303）

作者简介：成婧（1983—），女，湖南永州人，工程师，主要从事食品安全和环境安全检测技术研究，chengjing4323@163.com；*通信作者，王利兵，研究员，主要从事食品安全与检验检疫安全研究，wanglb0419@126.com