前列腺素E2与羟基磷灰石杂化对成骨样细胞株MC3T3-E1凋亡的影响

于国宁， 白雪涛， 白艳洁

作者单位：110016 辽宁 沈阳，辽宁省人民医院 (骨外科：于国宁，口腔正畸科：白艳洁)；中国医科大学附属第四医院 麻醉科(白雪涛)



实验研究

前列腺素E2与羟基磷灰石杂化对成骨样细胞株MC3T3-E1凋亡的影响

于国宁， 白雪涛， 白艳洁

作者单位：110016 辽宁 沈阳，辽宁省人民医院 (骨外科：于国宁，口腔正畸科：白艳洁)；中国医科大学附属第四医院 麻醉科(白雪涛)

目的 探讨前列腺素E2与羟基磷灰石杂化对成骨样细胞株MC3T3-E1凋亡的影响。方法 以无添加物培养基、终浓度为0.031 25 mg/ml的羟基磷灰石作为对照组，不同浓度的前列腺素E2、前列腺素E2+羟基磷灰石(羟基磷灰石终浓度为0.031 25 mg/ml，平均粒径为228.9 nm；前列腺素E2浓度分别为0.0125、0.0500、0.2000、0.8000，3.2000、12.8000 μmol/L)为实验组，与成骨样细胞株MC3T3-E1孵育，分别于不同时间，用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果 在6 d内，0.031 25 mg/ml的羟基磷灰石对MC3T3-E1细胞的凋亡无影响，随时间延长，促进凋亡发生，具有时间依赖性。0.0125 μmol/L的前列腺素E2+羟基磷灰石对MC3T3-E1细胞的凋亡具有抑制作用，但明显低于相同浓度的前列腺素E2，0.0500 μmol/L的前列腺素E2+羟基磷灰石对MC3T3-E1细胞的凋亡无明显抑制作用；0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L的前列腺素E2+羟基磷灰石对MC3T3-E1细胞的凋亡具有一定的促进作用，并高于相同浓度的前列腺素E2(P<0.05)，且具有时间和剂量依赖性。结论 浓度为0.031 25 mg/ml、平均粒径为228.9 nm的羟基磷灰石对MC3T3-E1凋亡无影响，安全时间为6 d左右，之后促进凋亡发生，具有时间依赖性；其与低浓度前列腺素E2杂化，抑制MC3T3-E1凋亡，与高浓度前列腺素E2杂化，促进MC3T3-E1凋亡并具有时间和剂量依赖性。

前列腺素E2; 羟基磷灰石; 成骨样细胞; 细胞凋亡

本系列实验之一是在制备PGE2-PLGAMSs缓释微球基础上，进一步行PGE2-PLGAMSs-HAP杂化凝胶的制备研究。由于 PGE2的双向浓度调节效应，我们需明确具有骨诱导作用的HAP与PGE2杂化后，能否如预期在PGE2低浓度时增强成骨，或高浓度时弱化骨吸收，即减少凋亡率，以及理想的HAP粒径大小，悬浮液中的安全浓度等。因此，自2015年1～6月，辽宁省人民医院探讨前列腺素E2与HAP杂化对成骨样细胞株MC3T3-E1凋亡的影响，以期为后续实验设计提供正确的指导及明确的观察指标。

1 实验材料

1.1 主要仪器 HeRA CellCO2恒温培养箱 (德国KENDRO公司)、Tecan Sunrise型酶标仪(奥地利TECAN公司)、CK40型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)、5804 R型低温高速离心机和200 μl、1 ml移液器(德国EPPENDORF公司)、SW-CT-IF型超净工作台(中国上海博讯公司)、BP 211D型电子天平(德国SARTORIUS公司)、Series 1000型超低温冰箱(美国KELVINATOR公司)、Tecan Sunrise全自动酶标仪(奥地利TECAN公司)，Delta 320型pH酸度仪(德国METTLER TOLEDO公司)、RCT Basic恒温磁力搅拌器(德国IKA公司)、SHZ-88型恒温水浴箱(中国江苏太仓公司)、FACSCalibur 流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 主要试剂 MEM培养基、MTT和TritonX-100(美国SIGNA公司)，小牛血清白蛋白(BSA，美国XIASI公司)，胎牛血清(美国HYCLONE公司)，OriCellTM小鼠成骨诱导培养液(美国CYAGEN BIOSCIENCES公司)，二甲基亚砜、EDTA、Trito-X100(中国北京华美生物工程公司)，前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2；中国武汉三洹公司)，HAP(沈阳药科大学自制)。

2 实验方法

2.1 成骨细胞株MC3T3-E1的细胞培养 将小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆 14[MC3T3-E1 Subclonel4,购自中国科学院上海细胞库(ATCC CRL-2594)]按每瓶3×105个培养于100 ml 10%小牛血清的DMEM培养液中，置于CO2孵箱(饱和湿度95%、5%CO2、37℃)孵育。根据细胞生长状况以及培养液的pH值变化，1～2 d换液1次，待细胞培养至对数生长期时传代。

2.2 成骨样细胞株MC3T3-E1的传代培养 当MC3T3-E1细胞株生长形成单层，铺满培养瓶底80%时，在无菌条件下传代。用D-Hank′s液清洗铺满细胞的培养瓶后，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 0.5 ml，室温下3～5 min，见瓶底出现针孔样透明时，吸去胰酶，加入含10%小牛血清的 DMEM 培养液，吹打细胞制成细胞悬液，按1∶3传代，置于CO2孵箱，每2 d换液1次。

2.3 成骨样细胞株MC3T3-E1的冻存和复苏 将铺满100 ml培养瓶的MC3T3-E1细胞用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化收集后，加入1 ml冻存液(含40%DMEM、50%小牛血清、5%DMSO、5%甘油)，吸入冻存管，分4个阶段从4℃～-196℃缓慢放入液氮罐内长期保存(约1℃/min)。细胞复苏时，采用快速复温法，将液氮中冻存的装有MC3T3-E1细胞的冻存管取出后，立即置于37℃水浴中复温，融化后，立即以DMEM培养液1500 r/min，离心10 min，清洗3次,再接种于细胞培养瓶，并置于CO2孵箱内培养。

2.4 HAP与PGE2杂化对小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1细胞凋亡的影响 ⑴将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02-EDTA消化后，加入10%FCS的MEM培养液,制成2×105细胞悬液加于12孔培养板中，每孔1 ml。待细胞铺满孔底后，分别将OriCellTM小鼠成骨诱导培养液稀释的不同浓度(0.0125、0.0500、0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L)PGE2、PGE2+HAP(HAP终浓度为0.031 25 mg/ml)加于24孔培养板中，2个对照组分别添加等量的培养液，将培养板置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。每2 d换液1/2。分别于第4、 6、 8、 10天取出，用Annexin V-PI 双染色法检测细胞凋亡。⑵用不含EDTA的胰酶消化各实验组细胞，吹打制成单细胞悬液，加入10 ml离心管中。⑶加入预冷的无钙、镁离子的PBS缓冲液，1000 r/min，离心5 min，洗涤2次，弃上清。⑷加入孵育缓冲液进行，1000 r/min，离心5 min。⑸加入100 μl 标记溶液重新悬浮细胞，避光条件下孵育15 min。⑹重复步骤3。⑺加入荧光溶液，4℃下避光孵育20 min。⑻采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

3 结果

3.1 前列腺素E2与HAP杂化对成骨样细胞株MC3T3-E1凋亡的影响 PGE2作用成骨细胞10 d后，用流式细胞仪检测其凋亡发生率。结果显示，0.031 25 mg/ml的HAP能促进MC3T3-E1细胞凋亡(P<0.05)。HAP与PGE2杂化对成骨细胞凋亡作用是双相的；与低剂量(0.0125 μmol/L)的PGE2杂化对成骨细胞增殖作用较强，凋亡发生率较低(P<0.05)；而与高剂量(3.2000 μmol/L)的PGE2杂化则抑制成骨细胞增殖，促进细胞凋亡(图1)。

3.2 HAP与PEG2杂化对成骨细胞凋亡的影响 实验结果显示，0.031 25 mg/ml HAP在第4、6天时，对MC3T3-E1细胞的凋亡无影响，在第8、10天时，具有一定的促进作用(P<0.05)，且具有时间依赖性。0.0125 μmol/L的PGE2+HAP在第4、6天时，与对照组及实验组相比，对细胞凋亡无明显影响；在第8、10天时，对MC3T3-E1细胞的凋亡具有抑制作用，但明显低于相同浓度的PGE2；0.0500 μmol/L的PGE2+HAP在第4天时，对凋亡有促进作用，第6、8、10天时，与空白组比较促进凋亡，但与HAP组比较无统计学意义(P>0.05)；0.0500 μmol/L PGE2组对凋亡无影响。0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L的PGE2+HAP在4个时间点对MC3T3-E1细胞凋亡均有促进作用，其促进作用明显高于相同浓度的PGE2(P<0.05)或HAP对照组，且具有剂量和时间依赖性。

统计分析结果提示，0.031 25 mg/ml HAP随时间延长，促进MC3T3-E1细胞凋亡(P<0.05)，且具有时间依赖性。0.0125 μmol/L的PGE2与HAP杂化随时间延长，抑制MC3T3-E1细胞的凋亡。0.0500 μmol/L PGE2与HAP杂化，与等浓度的PGE2相比，促进凋亡，与HAP组比较，对凋亡无影响。而0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L的PGE2与HAP杂化，则抑制成骨细胞增殖，促进细胞凋亡，且具有时间、剂量依赖性(图2)。

4 讨论

本研究通过预研究设定了6个浓度，即0.0125、0.0500、0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L的PGE2分别处理MC3T3-El 成骨细胞后，结果显示，PGE2与HAP杂化对成骨细胞凋亡的作用是双相的。这与前期研究PGE2对成骨细胞生物学性能及凋亡的双向调控的结论是一致的。即HAP的加入，未改变PGE2的双向调控特性。本研究HAP与低浓度PGE2杂化，减弱了抑制MC3T3-E1细胞凋亡作用；与高浓度PGE2杂化，促进凋亡，放大了促进作用。

本研究HAP粒径范围为90.0～1000.0 nm，平均粒径为228.9 nm,悬浮液浓度为0.03125 mg/ml。预研究显示,对MC3T3-E1细胞增殖无影响。而本研究HAP在组织液中第4、6天时，对细胞凋亡无影响，而第8、10天时，促进凋亡。推测HAP可能随时间改变出现生物降解，分散成更小颗粒，进而促进MC3T3-E1细胞的凋亡[1-4]。而研究报道证明，纳米HAP颗粒的尺度、形貌和剂量对其生物学活性都有明显的影响。Huang 等[5]发现，直径小于100.0 nm的HAP，尤其是针状的，可引起炎症反应。中国科学院高能物理所发现：生理盐水溶液中，尺寸小于100 nm的磁性纳米颗粒，进入动物体内导致血凝现象，凝聚成小鼠血管大小的颗粒，阻塞小鼠血管，导致其死亡。因此，我们在利用HAP诸多优良性能促进骨改建的同时，纳米尺寸带来的安全问题更需要我们的重视。Ding和Sun[6]研究了粒径为30.0～80.0 nm的球形纳米HAP对细胞生物学的效应，他们发现，纳米材料的作用浓度与细胞活力存在明显的正相关效应，当纳米颗粒的浓度达到200.0 μg/ml时，细胞出现明显的凋亡。而本研究所用浓度为0.031 25 mg/ml(相当于321.5 μg/ml)，明显高于文献浓度，这与刘小龙和张金超[7]的结论接近一致。本研究证明，此HAP悬浮液的浓度在6 d内是安全的，提示我们后续实验可以参考此结果，并严格控制HAP的粒径。另一可能是随着时间的延长，悬浮液中HAP出现团聚。有研究证实，将20.0～100.0 nm大小的HAP加入到培养基后，立刻聚集成500.0～700.0 nm的团块，细胞以主动耗能网格蛋白介导膜内陷形式吞噬nano-HAP[8]，并由此推论nano-HAP对细胞产生毒性可能通过2种方式，一种是吞噬了聚成团块的nallo-HAP的吞噬泡，本身破坏细胞结构，导致细胞退行性变；另一种是naIlo-HAP经过溶酶体部分消化后溶解，释放钙、磷酸根离子，达到细胞毒性浓度，导致细胞死亡。

本实验提示我们在后续实验中，需要继续探索以下诸多问题，如理想的HAP安全粒径及匹配的悬浮液浓度；如何制备粒径均匀的HAP；HAP悬浮液随时间延长促进凋亡的可能影响因素；如何合理利用HAP促进凋亡的作用等。而悬浮液中如何避免粒子团聚，合理使用何种分散剂将是我们后续实验的难点。

图1 双变量流式细胞仪散点图(左下象限代表活细胞，右上象限代表死细胞，右下象限代表凋亡细胞) 图2 PGE2与HAP杂化对成骨样细胞株MC3T3-E1凋亡的影响 a.第4天 b.第6天 c.第8天 d.第10天

Fig 1 Scatterplot of double variable flow cytometry (left lower quadrant represents the living cells, upper right quadrant shows the dead cells, the lower right quadrant represents the apoptotic cells). Fig 2 Effect of PGE2 and HA hybridization on apoptosis of osteoblast-like cell line MC3T3-E1. a. the fourth day. b. the sixth day. c. the eighth day. d. the tenth day.

[1] Tian A, Wang C, Xue XX, et al. Inhibitory efffect of nano-HA particles on human U87 glioblastoma cells viability[J]. Journal of Inorganic Materials, 2010,25(1):101-106.

[2] Li B, Guo B, Fan HS, et al. Preparation of nano-hydroxyapatite particles with different morphology and their response to highly malignant melanoma cells in vitro[J]. Applied Surface Science, 2008,255(2):357-360.

[3] Wang ZX, Hou Y, Han W, et al. Effects of hydroxyapatite nanoparticles on apoptosis and invasion of human renal cell carcinoma 7860 cells[J]. Chemical Research in Chinese Universities, 2011,27(1):94-98.

[4] Cai YR, Liu YK, Yan WQ, et al. Role of hydroxyapatite nanoparticle size in bone cell proliferation[J]. Journal of Materials Chemistry, 2007,17(36):3780-3787.

[5] Huang ZR, Hua SC, Yang YL, et al. Development and evaluation of lipid nanoparticles for camptothecin delivery:a comparison of solid lipid nanoparticles, nanostructured lipid carriers, and lipid emulsion[J]. Acta Pharmacol Sin, 2008, 29(9):1094-1102.

[6] Ding TT, Sun J. Effect on nanometer hydroxypatitie particles on rat macrophage at mRNA level[C]. 19th International Symposium on Ceramics in Medicine, 2006.

[7] 刘小龙, 张金超. 纳米羟基磷灰石对成骨细胞系MC3T3-E1的毒性研究[D]. 河北大学, 2014.

[8] Shi Z, Huang X, Cai Y, et al. Size effect of hydroxyapatite nanoparticles on proliferation and apoptosis of osteoblast-like cells[J]. Acta Biomater, 2009,(1):338-345.

Effect of PGE2 and HA hybridization on apoptosis of osteoblast-like cell line MC3T3-E1

YUGuo-ning,BAIXue-tao,BAIYan-jie.

(DepartmentofOrthopedicSurgery,People′sHospitalofLiaoningProvince,Shenyang110016,China)

BAIYan-jie,Email:yanjiebai2008@sina.cn

Objective To investigate the effect of prostaglandin E2 and hydroxyapatite (HPA) on the apoptosis of osteoblast-like cell line MC3T3-E1. Methods The control group consisted of a culture medium free of additives with a final concentration of 0.031 25 mg/ml HPA. The experimental group consisted of a different concentration of PGE2, PGE2+HAP (final concentration of HAP was 0.031 25 mg/ml, the average particle size of 228.9 nm; PGE2 concentrations were 0.0125, 0.0500, 0.2000, 0.8000, 3.2000, 12.8000 μmol/L). MC3T3-E1 incubated with osteoblast-like cell lines, respectively at different times. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. Results In 6 days, 0.031 25 HAP mg/ml had no effect on the apoptosis of MC3T3-E1 cells, with time, to promote the occurrence of apoptosis (P<0.05). A 0.0125 mol/L concentration of PGE2+HAP on apoptosis of MC3T3-E1 cells was inhibited (P<0.05), but was significantly lower than the same concentration of PGE2. There was no obvious inhibition effect in 0.0500 μmol/L concentration of PGE2+HAP on MC3T3-E1 cell apoptosis has a certain role in 0.2000, 0.8000, 3.2000, 12.8000 mol/L concentration of PGE2+HAP on MC3T3-E1 cell apoptosis, and higher than the same concentration of PGE2 (P<0.05), in a time and dose-dependent manner. Conclusion Neither the concentration of 0.031 25 mg/ml nor the average particle size of 228.9 nm HPA had any effect on the apoptosis of MC3T3-E1. The safe time is about 6 d, after which apoptosis was promoted in a time-dependent manner with low concentrations of PGE2 hybrid, MC3T3-E1 apoptosis inhibition, and high concentrations of PGE2 hybrid. Promotion of apoptosis of MC3T3-E1 was in a time and dose-dependent manner.

Prostaglandin E2; Hydroxyapatite; Osteoblast-like cell; Apoptosis

于国宁(1977-)，男，辽宁沈阳人，副主任医师，博士.

白艳洁，110016，辽宁省人民医院 口腔正畸科，电子信箱：yanjiebai2008@sina.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.11.019

R318

A

1673-7040(2016)11-0701-04

2016-09-10)