坦布苏病毒NS1蛋白的表达及ELISA检测方法的建立

提金凤，李志杰，李秀丽，张敏敏，张媛媛，刁有祥*



坦布苏病毒NS1蛋白的表达及ELISA检测方法的建立

提金凤1，2，李志杰2，李秀丽1，张敏敏1，张媛媛1，刁有祥1*

（1.山东农业大学动物科技学院，泰安271018；2.山东畜牧兽医职业学院，潍坊261061）

摘 要：为了建立坦布苏病毒（TMUV）感染鸭群的抗体检测方法，以TMUV NS1的原核表达蛋白质作为包被抗原，建立了间接ELISA方法，并对该方法进行了检测条件的优化。将TMUV NS1全基因序列克隆至pET－28a（＋），利用BL21（DE3）表达NS1蛋白，纯化后其质量浓度为4.16μg·μL－1。通过方阵试验，确定了NS1蛋白的最佳包被质量浓度是100ng·孔－1，检测血清的最佳稀释倍数为40倍。随后对检测条件进行了优化，优化后的结果：抗原的最佳包被条件是4℃作用过夜；酶标二抗的最佳工作条件是稀释5 000倍，37℃作用1h；阴阳血清的临界值为0.278。一系列试验验证了该检测方法具有很强的特异性、敏感性、重复性。对采集自山东各地的80份血清样品进行检测，其检测结果显示，该方法与经典的鸡胚中和试验检测结果的符合率为93.5%以上，且比传统的中和试验更敏感。对TMUV感染鸭群的血清进行检测，描述了TMUV感染后鸭群抗体水平的消长规律，为该病的防治提供重要的理论依据。以NS1蛋白为包被抗原的间接ELISA方法的建立为临床上TMUV的感染提供了一种新的抗体检测方法，尤其是在TMUV早期感染的检测方面有着更为广泛的应用前景。

关键词：鸭坦布苏病毒；NS1蛋白；间接ELISA；检测方法

坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）感染是近年来新出现的一种以水禽感染为主的病毒性传染病，产蛋鸭感染后主要表现为产蛋率下降，出血性卵巢炎；雏鸭感染后主要表现为扭脖、瘫痪等神经症状，死亡率较高［1－2］。该病毒于1955年最早从蚊子体内分离得到，属于黄病毒科、黄病毒属中的那他耶病毒群［3－5］。黄病毒属中的大多数病毒属于人畜共患，如登革热病毒、流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒、西尼罗病毒等，每年都会引起数百万的人群感染或死亡，严重威胁着全世界人们的生命健康［6］。

目前，针对TMUV感染的一些检测方法也已经陆续建立，如套式PCR检测方法［7］、荧光定量PCR［8］、地高辛探针检测法［9］、阻断ELISA［10］、间接ELISA（E蛋白为基础）［11］等。PCR方法主要是对病原进行检测，不能检测抗体；目前建立的阻断ELISA和间接ELISA检测方法，都是以E蛋白为包被抗原的检测方法，由于E蛋白是结构蛋白，以它为基础的检测方法不能区分活毒感染和灭活苗免疫产生的抗体［12］。而NS1蛋白是TMUV的一种非结构蛋白，非结构蛋白只有在活毒感染宿主细胞时才会出现，且该蛋白质具有非常重要的生物学功能，能刺激机体产生非中和性的保护性抗体。因此以该蛋白质为基础建立的ELISA检测方法可以区分活毒感染和灭活苗免疫，在生产实践将会有更广泛的临床应用，发挥更重要的作用。

本研究成功表达了TMUV NS1原核蛋白，并以此为基础建立了敏感性、特异性及稳定性均很强的间接ELISA检测方法，为TMUV早期感染及活病毒感染的检测提供了方便敏感的检测方法，为进一步研究NS1蛋白的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 病毒及血清

鸭坦布苏病毒SDSG株病毒由山东农业大学禽病研究所分离保存；新城疫（ND）、低致病性禽流感病毒（H9）、1型鸭肝炎病毒（DHV－1）、3型鸭肝炎病毒（DHV－3）、鸭瘟病毒（DPV）等的阳性血清均来自山东农业大学禽病研究所；血清样品从山东潍坊、泰安、菏泽等地的鸭场采集。

1.2 试剂

HRP标记的羊抗鸭酶标二抗，购自KPL公司；TMB底物显色液，购自北京天根生物科技有限公司；IPTG，购自索莱宝生物科技有限公司；Random Premier、Taq DNA聚合酶、pMD18－T试剂盒、质粒快速提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒等购自大连宝生物工程有限公司；Trizol试剂、反转录酶MLV、RNA酶抑制剂、ddH2O等均购自北京全式金生物技术有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器

台式冷冻高速离心机（Beckman Coulter）、普通PCR仪（Applied Biosystems 2720）、凝胶成像系统（BIORAD）、电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.4 NS1全基因原核重组表达载体的构建及鉴定

根据GenBank中TMUV NS1的全基因序列（登录号：KJ740748.1）设计引物，引物序列如下，NS1F：ACACGGGGTGCTCAA－TC－3′，（下划线为EcoRⅠ酶切位点）；NS1R：5′－CCGCCATGACCTTTGATTTGA－3′，（下划线为HindⅢ酶切位点）。引物由上海生物工程有限公司合成。以TMUV SDSG株的cDNA为模板，扩增NS1全基因序列。NS1基因的PCR产物回收后与原核表达载体PET－28a（＋）分别进行双酶切，回收后进行连接，构建NS1基因的原核重组表达载体pET－28－NS1，并对构建的表达载体进行双酶切及测序鉴定。

1.5 NS1重组蛋白质的诱导表达、纯化及鉴定

将鉴定为阳性的原核重组表达载体pET－28－NS1及空载体pET－28a（＋）同时转化至BL21 （DE3）表达菌中，挑取菌落，在LB（Amp＋）中培养过夜。5mL LB（Amp＋）中加入1.0%的新鲜菌液，37℃继续培养至OD600nm为0.6～0.8，加入终浓度为1mmol·L－1的IPTG，诱导1～6h，然后进行SDS－PAGE电泳。SDS－PAGE电泳参照分子克隆（第二版）进行。

1.6 融合蛋白质的制备和纯化

按照“1.5”所述的方法，诱导100mL菌液（含pET－28－NS1）。冰浴条件下超声波裂解菌液，12 000r·min－1×10min离心，取离心后的上清和沉淀进行SDS－PAGE电泳。蛋白质沉淀采用梯度尿素法（1、3、5mol·L－1的尿素溶液）进行洗涤纯化，每次12 000r·min－1×5min离心。纯化的蛋白质进行SDS－PAGE电泳，然后采用BSA蛋白含量测定试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）测定纯化后蛋白质的浓度。

1.7 间接ELISA检测方法的建立

1.7.1 抗原最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定 采用方阵滴定法，在96孔ELISA板中，将纯化后的NS1蛋白用0.05mol·L－1碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释至400μg·100μL－1，然后进行横向倍比稀释至25μg·100μL－1，每孔加入100μL，4℃包被过夜。然后加入倍比稀释的抗TMUV鸭阳性血清和阴性血清（纵向稀释），从1∶5稀释至1∶1 280，100μL·孔－1，37℃作用1.0h。PBST洗涤3次后加入羊抗鼠酶标二抗（1∶5 000稀释），50 μL·孔－1，37℃作用1.0h。PBST洗涤3次后加入TMB显色液，100μL·孔－1，37℃闭光显色15 min，加入2mol·L－1H2SO4终止反应，50 μL·孔－1，酶标仪测定OD450nm。阳性血清与阴性血清OD450nm比值（P/N值）最大时即为最佳抗原的包被浓度和血清稀释度。

1.7.2 抗原最佳包被条件的确定 以最佳抗原浓度包被ELISA板，分别采用37℃作用2h，4℃作用过夜，37℃作用2h后4℃过夜，三种条件进行孵育，其他条件不变。按照“1.7.1”中所述的步骤测定抗原的最佳包被条件。

1.7.3 最佳封闭条件的确定 封闭液分别采用5%的脱脂乳，4%的小牛血清；封闭时间分别采用37℃作用2h，4℃作用过夜，37℃作用2h后4℃作用过夜。其他条件不变，按照“1.7.1”中所述的步骤确定最佳封闭液和最佳封闭时间。

1.7.4 酶标二抗最佳工作条件的确定 对酶标二抗进行稀释，选择最佳的稀释倍数；酶标二抗作用的时间分别采用37℃1h，37℃2h，4℃作用过夜。其他条件不变，按照“1.7.1”中所述的步骤确定酶标二抗的最佳稀释倍数和最佳作用时间。

1.7.5 间接ELISA临界值的确定 采用本研究中建立的ELISA检测方法，对采集的20份TMUV阴性血清样品进行检测，每份样品检测3遍，计算样品的OD450nm值和标准差，阳性样品的临界值＝阴性OD450nm平均值＋3×标准差，当样品OD450nm值大于此值则判为阳性。

1.7.6 特异性鉴定 采用本研究中建立的ELISA检测方法，对新城疫（ND）、H9亚型禽流感（H9）、1型鸭肝炎病毒（DHV－1）、3型鸭肝炎病毒（DHV－3）、鸭瘟病毒（DPV）等的阳性血清进行检测，以确定该检测方法的特异性。

1.7.7 敏感性鉴定 将TMUV的阳性血清按1∶5～1∶1 280进行倍比稀释，采用本研究中建立的ELISA方法进行检测，以确定可以检测的血清最大稀释倍数，从而确定该方法的敏感性。

1.7.8 重复性鉴定 在同一块酶标板中检测10份血清样品，每份样品重复3孔，计算同一份血清样品的板内变异系数（CV%），以确定检测样品的板内重复性。

采用3块不同时间段包被的酶标板，对10份血清样品进行检测，计算同一份血清样品的板间变异系数（CV%），以确定检测样品的板间重复性。

1.8 临床样品的检测

从山东潍坊、泰安等地免疫过TMUV弱毒苗的种鸭场采集120份血清样品进行检测，同时与中和试验进行比较，从而确定该检测方法对临床样品的检测效率。

1.9 攻毒后雏鸭体内抗体水平的消长规律检测

对20日龄雏鸭攻毒TMUV，分别采集攻毒后1、3、5、7、9、11、13、15、17、21d的鸭血清，采用本研究建立的ELISA方法进行抗体检测，对攻毒后鸭体内TMUV抗体水平的消长规律进行鉴定。

2 结 果

2.1 NS1基因原核重组表达载体的鉴定

将重组质粒pET－28－NS1进行双酶切鉴定，酶切产物进行0.8%的琼脂糖电泳鉴定，结果出现大小为1 056bp的特异性条带（图1）。重组质粒测序结果显示，其序列与GenBank上TMUV NS1序列的相似性为100%。

图1 重组质粒pET－28－NS1双酶切鉴定Fig.1 The identification of double enzyme digestion of pET－28－NS1

2.2 NS1重组蛋白的表达及纯化

将原核重组表达载体pET－28－NS1及空载体pET－28a同时转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，终浓度为1mmoL·L－1IPTG分别诱导1～6h后，SDS－PAGE电泳结果显示，IPTG诱导5h后的蛋白质表达量最高，NS1蛋白大小为45ku左右（图2）。超声波裂解菌液，将菌液上清和沉淀分别进行SDS－PAGE电泳，结果显示，表达的蛋白质在沉淀中，以包涵体的形式存在。将超声波裂解后的菌液沉淀用不同浓度的尿素进行洗涤，最终获得纯度较高的表达蛋白质（图2）。纯化后的NS1蛋白的质量浓度为4.16μg·μL－1。

图2 NS1蛋白的原核表达及纯化后的SDS－PAGE鉴定Fig.2 Identification of SDS－PAGE of NS1protein prokaryotic expression and purification

2.3 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定

采用方阵滴度法，将纯化后的NS1蛋白倍比稀释后包被ELISA板，阳性血清和阴性血清倍比稀释后进行检测。结果显示，阳性血清与阴性血清OD450nm比值最高为9.44，NS1蛋白的质量浓度为100ng·孔－1，阳性血清的最佳稀释倍数为40倍。

2.4 抗原最佳包被条件的确定

采用最佳抗原包被浓度，在不同条件下进行包被，4℃作用过夜包被时，P/N（阳性血清与阴性血清的OD450nm比值）最大，且背景值最低。

2.5 酶标二抗最佳工作条件的确定

酶标二抗进行倍比稀释，待稀释倍数为5 000倍时，P/N最大；采用不同的二抗作用温度和时间，37℃作用1h时的P/N最大，且背景值最小。

2.6 间接ELISA临界值的确定

采用本研究建立的间接ELISA检测方法对20份鸭阴性血清进行检测，阴性血清OD450nm的平均值为0.137，标准差为0.047，根据公式临界值＝阴性OD450nm平均值 ＋3×标准差，阴阳性血清的临界值为0.278。

2.7 特异性试验

采用本研究建立的间接ELISA检测方法对新城疫（ND）、H9亚型禽流感（H9）、鸭肝炎病毒（DHV）、鸭瘟病毒（DPV）等的阳性血清进行检测，其OD450nm均小于临界值0.278，因此该检测方法具有良好的特异性。

2.8 敏感性试验

采用本研究建立的间接ELISA检测方法，将阳性血清进行一系列倍比稀释，待阳性血清稀释至1∶500倍时，其检测的OD450nm依然大于临界值。因此该检测方法具有较强的敏感性。

2.9 重复性试验

用同一块包被好的ELISA板检测10份不同的血清样品，每份样品重复3次，其样品的板内变异系数为0.68%～1.321%；用3块不同批次包被的ELISA板检测10份血清，每份样品重复3次，其检测结果的板间变异系数为0.53%～2.413%，变异系数均小于5%。因此，该检测方法具有非常好的重复性。

2.10 临床样品的检测

对采集自山东各地区免疫过TMUV弱毒苗的鸭血清样品进行检测，分别采用本研究建立的ELISA方法和经典的鸡胚中和试验，其检测结果见表1。结果显示，中和试验检测为阳性的样品（中和滴度SNT≥5），ELISA检测结果也为阳性，两种方法检测的阳性样品的符合率为93.5%以上，而且，本研究建立的ELISA检测方法比传统的中和试验更敏感。在112份中和试验检测为阳性的样品中，有的血清样品中和滴度较低，但ELISA检测的效价相对较高。但两种方法对血清样品阳性率的检测结果是一致的（表2）。

表1 两种检测方法对临床样品检测的比较Table 1 Comparison of two detection assays for the detection of 120clinical samples

表2 两种检测方法对临床样品检测的比较（部分样品）Table 2 Comparison of two detection assays for the detection of clinical samples（some samples）

2.11 免疫后雏鸭体内抗体水平的消长规律检测

对20日龄樱桃谷鸭攻毒TMUV，分别间隔2d采集攻毒后的鸭血清，采用本研究建立的ELISA方法进行抗体检测，检测结果如图3所示。鸭群在攻毒后第5天抗体水平开始转阳，之后抗体水平持续升高，攻毒后15d达到最高，之后抗体滴度开始下降。该检测结果展示的抗体消长规律与孙晓燕（X. Y.Sun）等通过中和试验检测的TMUV感染鸭群的抗体消长水平是一致的［13］，而且该方法能更早检测到鸭群抗体转阳。这与临床上鸭群感染TMUV后出现的抗体变化规律基本是一致的。因此，该方法可以用于临床上TMUV感染鸭群或免疫鸭群血清抗体水平的检测，为临床上更好地预防和控制该病制定合理的免疫措施和防制措施。

图3 20日龄桃谷鸭攻毒TMUV后抗体水平的检测Fig.3 Detection of antibodies to TMUV in ducks after inoculation at 20dpi

3 讨 论

坦布苏病毒属于黄病毒属中的蚊媒类病毒，蚊蝇在该病毒的传播中发挥着重要的媒介作用［1］。自从2010年该传染病在我国东南部鸭场出现以来，该病毒在较短的时间内迅速传播到全国绝大多数的养鸭地区，给我国的养鸭业造成了严重的经济损失［14］。坦布苏病毒基因组全长为10 990kb，包含一个开放阅读框，编码一个多聚蛋白，包括3种结构蛋白（C、prM、E）和7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）［14］。其中NS1蛋白是一种与膜功能密切相关的糖蛋白，包含多个T细胞和B细胞表位，参与病毒感染的免疫应答反应，能刺激机体产生非中和性的保护性抗体，在机体的免疫应答反应中发挥着极为重要的作用［16－18］。尤其重要的是，NS1蛋白不会产生病毒的抗体依赖性感染增强作用，这就意味着该蛋白质在疫苗的制备、蛋白质功能的研究及检测方法的建立等方面将发挥重要的作用［19］。

目前，对于TMUV感染的检测方法有多种，其中ELISA方法具有操作简单、快速，可同时检测大量样品的优点，在临床检测中可广泛应用。多数检测黄病毒的商品化ELISA试剂盒采用灭活的全病毒作为抗原，但全病毒的纯化难度大，成本高，而且容易出现与其他黄病毒的交叉反应［20］。TMUV的纯化同样也面临着这样的问题，而且该病毒的病毒滴度下降较快。因此，以该病毒的结构或非结构蛋白为抗原来建立检测方法就有更广泛的应用价值。本研究以NS1蛋白为包被抗原，建立了检测TMUV活毒感染的间接ELISA检测方法，并且对该方法进行了系列优化。目前，我国尚无该抗体检测的商品化ELISA试剂盒。

本研究通过原核表达系统成功表达了TMUV NS1蛋白，并利用不同浓度的尿素溶液对表达的蛋白进行纯化。若包被抗原的纯度不高，会严重影响到检测方法的敏感性、特异性和重复性。纯化后的NS1蛋白含量及纯度均很高，为ELISA检测方法的成功建立奠定了基础。NS1蛋白是TMUV的一种非结构蛋白，只有在活毒感染机体时才会产生，并且该蛋白质是在病毒复制早期出现的［21］。因此，以NS1蛋白为包被抗原的ELISA检测方法可用于TMUV早期感染的诊断。

ELISA检测方法的特异性和敏感性与抗原的包被浓度、待测血清的稀释倍数也有密切的关系。若抗原包被浓度过高，抗原蛋白质分子之间频繁的相互作用容易造成蛋白质分子的多层化，使包被抗原在洗涤时容易被洗掉，导致检测结果出现非特异性；若浓度太低，载体表面吸附的抗原量不够，同样也可能出现假阴性，从而影响ELISA检测结果的敏感性［22］。本研究通过方阵试验筛选出了抗原的最佳包被剂量，NS1蛋白的最佳包被量为100ng·孔－1。该抗原的包被量适中，符合抗原的包被要求。而谢星星等［23］建立的ELISA检测方法，其NS1蛋白的包被剂量为192ng左右，包被剂量是本研究中NS1蛋白包被剂量的二倍，这也表明本研究中表达的NS1蛋白纯度及活性更强，建立的检测方法的敏感性、特异性和稳定性更强。

同时，本研究对建立的ELISA检测方法的其他条件，如抗原的包被时间和温度、二抗的作用条件、敏感性、特异性和重复性等也分别进行了优化和鉴定。通过优化抗原的包被条件及二抗的作用条件，成功解决了鸭血清检测时背景值较高的缺陷。该检测方法具有良好的特异性，与TMUV的阳性血清反应敏感，而与新城疫（ND）、H9亚型禽流感（H9）、鸭肝炎病毒（DHV）、鸭瘟病毒（DPV）等的阳性血清无任何交叉反应。该方法的敏感性很高，阳性血清稀释至1∶500倍时，其检测结果依然大于临界值。该方法的重复性很强，板间和板内的变异系数均小于5%。

应用该检测方法对临床上120份鸭血清样品进行检测，并且与血清中和试验进行比对，结果显示该检测方法具有更高的阳性检出率。通过检测接种TMUV后的20日龄樱桃谷鸭体内抗体水平的消长规律，为临床上TMUV免疫及防治程序的合理制定提供了理论依据。而且本研究建立的ELISA检测方法能更早得检测到鸭群抗体转阳的时间，这可能是由于NS1蛋白是病毒感染早期产生的蛋白质，因此其抗体在TMUV感染后也能较早检测到，这在TMUV早期感染的检测及诊断中有着重要的意义，这也为更好地预防和控制该病提供更加有效检测手段［12］。而且NS1蛋白是TMUV一种非结构蛋白，因此可以对实际生产中的TMUV野毒或活毒感染的水禽进行检测，从而确定水禽的活毒感染情况，而以E蛋白为包被抗原的ELISA方法却不能区分活毒或灭活苗的免疫［12］。

因此，本研究建立的以NS1蛋白为基础的间接ELISA检测方法将在临床检测中发挥着重要的作用，为更好地检测和防控该病提供了一种敏感性、特异性和重复性强，操作简单，检测成本较低的检测方法。

4 结 论

作者建立了以TMUV非结构蛋白NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法，该方法具有良好的特异性、稳定性和重复性。通过临床应用，该方法比中和试验敏感性更高，且操作简单、省时省力、检测成本较低；而且可以应用于临床上TMUV感染或免疫鸭群血清中抗体水平的检测，为临床上更好地预防和控制该病的发生提供了重要的检测手段及理论依据。

参考文献（References）：

［1］ CAO Z，ZHANG C，LIU Y，et al.Tembusu virus in ducks，China［J］.Emerg Infect Dis，2011，17（10）：1873－1875.

［2］ SU J，LI S，HU X，et al.Duck egg－drop syndrome caused by BYD virus，a new Tembusu－related flavivirus［J］.PLoS One，2011，6（3）：e18106.

［3］ BOWEN E T，SIMPSON D I，PLATT G S，et al.Arbovirus infections in Sarawak，October 1968－February 1970：human serological studies in a land Dyak village ［J］.Trans R Soc Trop Med Hyg，1975，69（2）：182－186.

［4］ KARABATSOS N.Supplement to international catalogue of arboviruses including certain other viruses of vertebrates［J］.Am J Trop Med Hyg，1978，27（2Pt 2Suppl）：372－440.

［5］ OLSON J G，KSIAZEK T G，GUBLER D J，et al.A survey for arboviral antibodies in sera of humans and animals in Lombok，Republic of Indonesia［J］.Ann Trop Med Parasitol，1983，77（2）：131－137.

［6］ LI S，LI X，ZHANG L，et al.Duck Tembusu virus exhibits neurovirulence in BALB/c mice［J］.Virol J，2013，10：260.

［7］ 颜丕熙，李国新，吴晓刚，等.应用套式RT－PCR快速检测鸭坦布苏病毒［J］.中国动物传染病学报，2011，19（3）：34－37.YAN P X，LI G X，WU X G，et al.Rapid identification of duck Tembusu virus by the nested RT－PCR［J］.Chinese Journal of Animal Infectious Diseases，2011，19（3）：34－37.（in Chinese）

［8］ 于春梅，刁有祥，唐 熠，等.坦布苏病毒荧光定量RT－PCR方法的建立［J］.中国农业科学，2012，45 （21）：4492－4500.YU C M，DIAO Y X，TANG Y，et al.Fluorescence quantitative RT－PCR assay for detection of Tembusu virus［J］.Scientia Agricultura Sinica，2012，45（21）：4492－4500.（in Chinese）

［9］ 高绪慧，刁有祥，唐 熠，等.探针检测鸭黄病毒的地高辛标记DNA的制备与应用［J］.中国兽医学报，2012，32（4）：525－528.GAO X H，DIAO Y X，TANG Y，et al.Preparation of digoxigenin－labeled DNA probe for detection of duck flavivirus and its application［J］.Chinese Journal of Veterinary Science，2012，32（4）：525－528.（in Chinese）

［10］ LI X，LI G，TENG Q，et al.Development of a blocking ELISA for detection of serum neutralizing antibodies against newly emerged duck Tembusu virus［J］.PLoS One，2012，7（12）：e53026.

［11］ 姬希文，闫丽萍，颜丕熙，等.鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2011，33（8）：630－634.JI X W，YAN L P，YAN P X，et al.Establishment of an indirect ELISA for detection of antibody against duck Tembusu virus［J］.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2011，33（8）：630－634.（in Chinese）

［12］ SHU P Y，CHEN L K，CHANG S F，et al.Dengue NS1－specific antibody responses：isotype distribution and serotyping in patients with Dengue fever and Dengue hemorrhagic fever［J］.J Med Virol，2000，62 （2）：224－232.

［13］ SUN X Y，DIAO Y X，WANG J，et al.Tembusu virusinfection in Cherry Valley ducks：the effect of age at infection［J］.Vet Microbiol，2014，168（1）：16－24.

［14］ YAN P，ZHAO Y，ZHANG X，et al.An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China［J］.Virology，2011，417（1）：1－8.

［15］ YUN T，YE W，NI Z，et al.Identification and molecular characterization of a novel flavivirus isolated from Pekin ducklings in China［J］.Vet Microbiol，2012，157 （3－4）：311－319.

［16］ LINDENBACH B D，RICE C M.trans－Complementation of yellow fever virus NS1reveals a role in early RNA replication［J］.J Virol，1997，71（12）：9608－9617.

［17］ SCHLESINGER J J.Flavivirus nonstructural protein NS1：complementary surprises［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103（50）：18879－18880.

［18］ TAFUKU S，MIYATA T，TADANO M，et al.Japanese encephalitis virus structural and nonstructural proteins expressed in Escherichia coli induce protective immunity in mice［J］.Microbes Infect，2012，14 （2）：169－176.

［19］ HUA R H，LIU L K，CHEN Z S，et al.Comprehensive mapping antigenic epitopes of NS1protein of Japanese encephalitis virus with monoclonal antibodies［J］.PLoS One，2013，8（6）：e67553.

［20］ 靳宇田.鸭坦布苏病毒JS2010株的分离鉴定及间接ELISA检测方法的建立［D］.安徽：安徽农业大学，2013.JIN Y T.Isolation and identification of duck Tenbusu virus JS2010strain and Establishment of indirect ELISA to detect antibodies against duck Tembusu virus［D］.Anhui：Anhui Agricultural University，2013.（in Chinese）

［21］ PACCA C C，SEVETINO A A，MONDINI A，et al.RNA interference inhibits yellow fever virus replication in vitro and in vivo［J］.Virus Genes，2009，38 （2）：224－231.

［22］ 张文文.猪TTV2ORF1基因的原核表达以及间接ELISA检测方法的建立［D］.南京：南京农业大学，2012.ZHANG W W.Prokaryotic expression of open reading frame 1gene of torque teno virus 2and development of an indirect ELISA diagnostic method［D］.Nanjing：Nanjing Agricultural University，2012.（in Chinese）

［23］ 谢星星，李祥瑞，李 银，等.检测坦布苏病毒病抗体NS1－ELISA方法的建立与初步应用［J］.浙江农业学报，2014，26（1）：135－140.XIE X X，LI X R，LI Y，et al.Establishment of an NS1－ELISA for detection of antibody against Tembusu virus and initial application［J］.Acta Agriculturae Zhejiangensis，2014，26（1）：135－140.（in Chinese）

（编辑 白永平）

Expression of NS1Protein of Tembusu Virus and Development of Indirect ELISA Assay

TI Jin－feng1，2，LI Zhi－jie2，LI Xiu－li1，ZHANG Min－min1，ZHANG Yuan－yuan1，DIAO You－xiang1*
（1.Animal Science Institute，Shandong Agricultural University，Tai’an271018，China；2.Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College，Weifang261061，China）

Abstract：In order to establish a detection method about the antibodies to Tembusu virus （TMUV），TMUV NS1prokaryotic expression protein was used as a coating antigen and an indirect ELISA method was established and optimized.TMUV NS1gene sequence was cloned into pET－28a（＋）and the recombinant expression vector PET－28－NS1was developed.pET－28－NS1 was transformed into BL21（DE3）and the fusion protein NS1was successfully expressed.The NS1protein was purified with different concentrations of urea and the concentration of NS1protein was 4.16μg·μL－1.According to phalanx test，the coating concentration of NS1protein was 100ng·cell－1and the detected serum was diluted by 40times.The detection conditions were optimized and the optimized conditions were as follows.The best incubation condition was overnight at 4℃；the secondary antibody was diluted by 5 000times and incubated for 1hat 37℃；the critical value of serum was 0.278.It was verified by a series of tests that the ELISA method based on NS1protein had a higher specificity，sensitivity and reproducibility.Eighty serum samples collected from Shandong province were detected.The coincidence was above 93.5%between the resultsof ELISA and conventional neutralization test.Serums in ducks infected with TMUV were detected by the ELISA assay and dynamic changes of antibody levels were described.Prevention and control measures of this disease can be developed according to antibody characteristics.A new method for detecting antibodies to TMUV is developed and will provide wide use in the early detection of TMUV.

Key words：duck Tembusu virus；NS1protein；indirect ELISA；detection methods

中图分类号：S858.325.3

文献标志码：A

文章编号：0366－6964（2016）05－0970－08

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.014

收稿日期：2015－10－20

基金项目：国家自然科学基金（31272583；31472199）；国家水禽产业技术体系项目（CARS－43－10）；山东省科技发展计划项目（2014GNC111023）

作者简介：提金凤（1977－），女，山东莱州人，讲师，硕士，主要从事动物病毒学研究，Tel：0538－8249851，E－mail：cora865@126.com

*通信作者：刁有祥，Tel：0538－8249851，E－mail：yxdiao@163.com