艾滋病热毒蕴结证的miRNA差异表达研究

姜　岑,曹春辉,李白雪,冯全生△

(1.成都中医药大学基础医学院　610075;2.重庆市中医院　400011)



艾滋病热毒蕴结证的miRNA差异表达研究

姜岑1,曹春辉2,李白雪1,冯全生1△

(1.成都中医药大学基础医学院610075;2.重庆市中医院400011)

[摘要]目的研究艾滋病(AIDS)热毒蕴结证患者与健康对照组间miRNA表达差异。方法运用Agilent miRNA芯片对AIDS期热毒蕴结证患者与健康对照组血液标本进行miRNA检测，采用SAS等系统对组间差异miRNA进行筛选，并对相应的miRNA进行靶基因预测和靶基因功能显著性分析。结果热毒蕴结证组与健康对照组比较，共筛选出表达有显著性差异且倍数差异(FC)大于2的miRNA 100条，其中64条上调，36条下调。差异表达miRNAs功能涉及T细胞活化中的IL-21受体的作用、C反应蛋白、免疫效应的过程中的正调控等。结论AIDS热毒蕴结证患者与健康对照组间存在差异miRNA表达，其证候生物学基础可能与T细胞活化中的IL-21受体的作用等相关。

[关键词]获得性免疫缺陷综合征；热毒蕴结证；miRNA；靶基因

艾滋病(AIDS)是感染人免疫缺陷病毒(HIV)引起的一种严重威胁人类健康的致死性传染病，目前人类还没有完全治愈此病的方法，我国医学在防治AIDS方面具有一定的优势与特色。随着中医药防治AIDS临床及科研工作的不断深入，很多亟待解决的问题已逐渐显现出来。提升中医药防治AIDS水平，辨证是关键，所以建立客观化、标准化的艾滋病中医证候诊疗体系具有重要意义。miRNA是非编码小分子RNA，在基因转录后过程中起重要调节作用[1]。本文引入基因芯片技术研究AIDS中医典型证候，筛选AIDS期热毒蕴结证患者差异表达的miRNA，本文为进一步探讨AIDS中医证候的生物学基础，为AIDS的中医证候研究提供客观依据。

1资料与方法

1.1一般资料本研究的病例来自于临床上符合纳入标准和排除标准的AIDS期患者，本研究纳入热毒蕴结证患者25例，健康对照受试者8例。其中，西医诊断标准参考2011版《艾滋病诊疗指南》，中医诊断标准参考2004版《中医药治疗艾滋病临床技术方案(试行)》。纳入标准：(1)符合西医诊断标准和中医辨证标准者；(2)年龄大于18岁且小于65岁；(3)自愿参加本研究，签署知情同意书者。符合以上所有条件者，才能纳入本研究。排除标准：(1)孕妇及哺乳期患者；(2)合并恶性肿瘤患者；(3)神志不清、痴呆、各种精神病患者及家属不愿意合作者；(4)合并乙型、丙型病毒性肝炎等慢性肝病患者；(5)原发性免疫缺陷，激素化疗等引起的继发性免疫缺陷，血液病，其他原因引起的中枢神经系统疾病；非感染HIV所患的脏器严重疾病;(6)研究者认为不适合纳入研究的患者,以上有一项是“是”者，排除观察。

1.2方法根据诊断标准、纳入标准、排除标准纳入符合要求的病例。其中AIDS热毒蕴结证组25例、健康对照组8例。采集AIDS患者和健康对照组血液标本，-80 ℃低温保存，干冰密封保存，送往生物芯片公司，进行Agilent基因芯片的检测，并采用SAS差异性分析系统筛选差异表达miRNA的筛选，并对差异性miRNA进行靶基因功能显著性分析。

1.3统计学处理采用SAS系统筛选两组间的差异表达miRNA，用Targetscan等数据库进行差异表达miRNA靶基因预测，并在SAS系统中进行靶基因功能显著性分析(GO分析)。

2结果

2.1热毒蕴结证组与健康对照组差异miRNA热毒蕴结证组与健康对照组比较，共筛选出表达有显著性差异(P<0.05)且倍数差异(fold chang，FC)大于2的miRNA 100条，其中64条上调，36条下调，见图1。

2.2AIDS期热毒蕴结证组差异miRNA分析将筛选出有显著性差异miRNA进行靶基因预测，再用SAS系统对差异表达miRNA进行功能显著性分析(GO分析)。AIDS期热毒蕴结证组的差异表达显著性miRNAs靶基因预测,共筛选出靶基因5 536条，其中上调miRNA共筛选出3 620条靶基因，下调miRNA共筛选出1 916条靶基因。然后将筛选出的靶基因进行功能显著性分析(P<0.05)，结果发现这些基因功能主要涉及：T细胞活化IL-21受体的作用，C反应蛋白(CRP)，免疫效应过程中的正调控，氧化应激，血小板，对病毒的防御反应，干细胞分裂，分解代谢过程，水解酶活性，RNA聚合酶，补体激活，脂质运输，信号传导，T细胞介导的细胞毒性等，见图2。

图1　两组差异表达的miRNA火山图

图2　两组差异miRNA GO 分析(主要)

3讨论

本研究选择外周血浆中的miRNA，主要原因是miRNA和免疫系统关系十分密切，大量研究表明：(1)miRNA广泛参与免疫细胞的增殖、分化、免疫应答和免疫性疾病调控，同时与病毒感染关系密切[2-3]；(2)AIDS实质上是免疫系统疾病，其感染人体及致病与免疫系统密切相关；(3)前期研究表明，如Pegtel等[4]发现外周血中的miRNA可能是细胞主动合成，而并非靶细胞凋亡后被动释放出来；Chen等[5]发现哺乳动物外周血清、血浆中存在含量和理化性质稳定的miRNA，即提取外周血中的miRNA操作简便可靠。故本研究选择外周血浆中的miRNA具有理论和实践基础。

热毒蕴结证筛选出的差异miRNA靶基因功能主要有以下方面：氧化应激，血小板，CRP，T细胞活化IL-21受体的作用，免疫效应的过程中的正调控，信号传导、脂代谢等。

CRP是肝脏合成的一种急性时相反应蛋白。在创伤、感染、炎症反应等情况下，血浆CRP水平迅速升高。余丰等[6]研究了CRP水平与HIV/AIDS患者抗病毒治疗及预后的关系，CRP在HIV/AIDS患者中高表达，与疾病进展呈正相关。在HIV/AIDS病程中，血小板减少主要与HIV对骨髓巨细胞的损害、抗血小板生成抑制、抗体形成等有关[7]，临床上，可出现迫血妄行，发斑发疹，苔黄脉数等表现，与血小板减少症状相符。众多研究证实，HIV感染者体内处于慢性氧化应激状态，表现为HIV的复制能力增强，免疫细胞的增生减少，甚至丧失免疫功能。同时，HIV可诱导细胞凋亡与对药物毒性的敏感性增加[8]。韩晓群等[9]发现HIV/AIDS患者机体氧化还原态越偏向氧化方向，标志着AIDS患者病情的进展。IL-21是近来发现的具有免疫调节作用的细胞因子，研究表明[10]，HIV感染中，IL-21可增强CD8+T细胞上粒溶素和穿孔素表达，增强NK细胞的毒性和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用，其可增加它们抗病毒能力，且不会引起免疫细胞的活化。

研究发现，在AIDS期热毒蕴结证患者筛选出的差异miRNA中，Has-miR -126通过参与体内脂代谢的调控，影响动脉粥样硬化的发展进程[11]，其通过调控PI3K/Akt通路来调节T淋巴细胞的免疫活性和功能[12]。Has-Let-7f能抑制记忆T细胞中IL-23的表达，但Has-Let-7f在记忆性T细胞的内源性表达和幼稚T细胞中相比显著偏低[13]。

综上所述，AIDS期热毒蕴结证患者与健康人的体内存在着差异表达的miRNA谱，其证候生物学基础可能是与T细胞活化中的IL-21受体的作用，CRP、血小板、氧化应激等相关。

参考文献

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Research of miRNA differential expression of AIDS with the syndrome of heat-toxic accumulation

Jiang Cen1,Cao Chunhui2,Li Baixue1,Feng Quansheng1△

(1.SchoolofBasicMedicine,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China;2.ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400011,China)

[Abstract]ObjectiveThe Study the difference of miRNA expression of AIDS patients with toxic heat accumulation syndrome with healthy control group.MethodsThis research used Agilent miRNA chip to test the miRNA of blood preparation,and used SAS system to screen the differences between groups,then analyzed the significance function of target gene.ResultsCompare the heat-toxic accumulation group and the healthy control group,100 cases of obvious expression difference and of which the difference was 2 times and greater were screened out (in which 64 cases showed up-regulation and 36 showed down-regulation).Differentially expressed miRNAs function involves the role of IL-21 receptor in T cell activation,C reactive protein,and the positive regulation of the immune response.ConclusionAIDS toxic heat accumulation syndrome patients and healthy control groups exist differences in miRNA expression profiles,the biological basis of syndrome maybe related to T cell activation and IL-21 receptor.

[Key words]AIDS;heat-toxic accumulation;miRNA;target gene

作者简介：姜岑(1987-),讲师，博士，主要从事中西医结合与复方配伍研究。△通讯作者，Tel:13688120528；E-mail:fengqs@163.com。

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.020

[中图分类号]R512.91

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)17-2365-02

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-03-11)