禽脑脊髓炎的实验室诊断与预防措施

雷文杰/河南省平舆县动物卫生监督所



禽脑脊髓炎的实验室诊断与预防措施

雷文杰/河南省平舆县动物卫生监督所

禽脑脊髓炎是由肠道病毒属的禽脑脊髓炎病毒侵害幼龄鸡的一种病毒性急性传染病。病原为禽脑脊髓炎病毒。属于RNA病毒科。该病一年四季均可发生，可感染任何年龄鸡， 1～2周龄雏鸡最易感。3周龄以上的鸡对本病有抵抗力，感染时临床症状不明显。该病主要是雏鸡共济失调，两肢轻瘫，头颈肌肉震颤，母鸡产蛋急剧下降等为特征。由于传播速度快，感染率高，如果诊断、治疗不及时常常会给养殖户带来巨大经济损失。现将禽脑脊髓炎的实验室诊断及预防措施介绍如下。

一、实验室诊断

1.病毒分离。取病死鸡脑组织，经研磨后，用灭菌生理盐水制成1∶10悬乳液，经1 500转/分，离心沉淀15 min，加入青霉素600～2 000 μg/ml，置4℃冰箱中过夜，取其上清液0.1毫升，接种于5～7日龄的鸡胚卵黄内。在接种后12 d如观察到鸡胚不活动、腿肌萎缩和鸡胚死亡，则可判断病死鸡脑组织中含有禽脑脊髓炎病毒。在接种后12 d后鸡胚虽未病变，但在鸡胚孵出后10 d的雏鸡出现共济失调，两肢轻瘫，头颈肌肉震颤等禽脑脊髓炎病的特征性症状，也可证实脑脊髓炎病毒的存在。

2.动物实验。采取病死鸡脑组织，加无菌生理盐水1∶10悬液，接种于1～2月龄雏鸡。每只鸡脑内注射0.1 ml，或腹腔注射0.5 ml。12～14日龄开始发病，临床症状表现共济失调、麻痹或头、颈震颤等特征性神经症状。以致发生瘫痪或衰竭，严重的则俯卧不起，两肢向一侧伸直至死亡。组织学观察，神经细胞产生轴突型变性，腺胃基层、胰脏间质中有淋巴滤泡等特有病变。

3.中和试验。中和试验是采用适应于鸡胚内可以生长的菌株，来确定血清或血浆的中和能力。其方法如下：

将未作稀释的被检血清与1∶10、1∶20、1∶40稀释的病毒液混合，用22号针头，接种于对脑脊髓炎易感的6日龄鸡胚卵黄囊内，每个稀释度接种5枚鸡胚。于接种后10～12天检查鸡胚有无典型的脑脊髓炎病变，以确定病毒的滴定终点，并以中和指数表示（即ELD50病毒滴度和ELD50病毒-血清滴度之间的对数差异计算）一般中和指数为1.1或大于1.1时被认为感染过病毒的可靠证据，新感染的鸡群，其中和指数可在1.5～3.0范围内。

4.免疫荧光抗体检查。

（1）试验准备。

荧光抗体：用脑脊髓炎病毒感染鸡，制备的高价血清，再用异硫氰酸荧光黄标记而制成荧光抗体或由兽医生物厂家生产。

被检材料：采取疑为被感染鸡的脑、胰腺等组织。

（2）操作方法。

制片：将脑、胰腺等组织脏器制成6～7微米的冰冻切片。

固定：将切片粘贴于载玻片上，自然干燥后，再用丙酮固定10分钟。

染色：将固定好的载玻片，用荧光抗体（标记荧光素的特异禽脑脊髓炎病毒血清）于室温在湿盒染色30分钟。再将载玻片放在PH7.4磷酸盐缓冲液中，洗涤20分钟，加盖玻片并用PH7.4的磷酸盐缓冲液-甘油等量混合液封固，在荧光显微镜下观察。

（3）结果判定：在病变组织内如见有亮绿色的禽脑脊髓炎病毒抗原时，判为阳性，否则判为阴性。

5.琼脂扩散试验。

（1）试验准备。

抗原：将已接种经驯化病毒的鸡胚脑组织悬液，浓缩制成抗原。

被检血清：采集被检鸡血而分离的血清。

琼脂平板：取优质琼脂粉1 g，加入含1/万硫柳汞的0.01M磷酸盐缓冲液100毫升，于水浴中煮沸溶解、过滤。置120℃高压灭菌15 min，倒入无菌平皿，待凝固后立即使用或置4℃冰箱中保持备用。

（2）操作方法。取制备好的琼脂板，用打孔器，中央打1孔，孔径4毫米，加抗原；周边打6孔，孔径6毫米，1、2、4、5孔加被检血清；3孔加已知阴性血清，6孔加已知阳性血清，抗原孔与血清孔之间的空间距为4毫米（如图1）。

图1 鸡脑脊髓炎琼脂扩散反应示意图

抗原与血清滴加量以加满孔不溢出为宜。然后将琼脂平板置于湿盒中，放37℃温箱中24～48 h观察结果。

（3）结果判定：抗原与被检血清孔和已知阳性血清孔之间，同时出现的沉淀线，而阳性血清孔不出现沉淀线判为阳性。否则判为阴性。

二、防治措施

1.搞好消毒措施。环境卫生消毒是预防禽脑脊髓炎病的的有效措施之一。定搞好环境卫生，及时清除传染源。对禽舍内的粪便和垫料要及时清除，定期对养殖用具（水槽、料槽等）进行清洗消毒，保持舍内地面干燥，对舍内外环境进行定期消毒。

2.加强饲养管理。合理安排饲养密度，掌控好禽舍内的温度和湿度，保持舍内通风良好，同时饲喂营养均衡的全价饲料，在饮水或饲养中添加多种维生素、电解多维和黄芪多糖，来增强禽群的免疫力，增强抗病能力，同时也可避免应激病的发生。

3.建立健全防疫制度。禽场要实行封闭式管理，激励健全的兽医卫生防疫制度，减少人员流动，降低疫病的传播速度，防治外源性致病菌传入。

4.做好疫苗接种。目前，接种疫苗是预防本病的最有效方法。采用弱毒疫苗对13周龄后备种禽经饮水进行首次免疫接种弱毒苗，15周龄时经饮水进行二次免疫接种弱毒苗；用弱毒苗通过饮水或喷雾等途径免疫产蛋前5周的母禽，使其产生的母源抗体能保护2周雏禽不受在本病毒的接触感染，而降低感染率。通过以上免疫方法，该病的免疫期可达1年以上。

5.坚持自繁自养原则。坚持自繁自养和全进全出饲养制度，可以防止疾病的传入或扩散。尽量做到自繁自养，避免外来病带入。如需引种，需到规模化、正规化、规范化种禽场引进，引进前需做该病的病原检测，确定为禽脑脊髓炎为阴性的禽群，方可引进，引进后也要隔离1个月，确定健康后，方可并群饲养。