扁蒴藤素对人乳腺癌MCF-7细胞生长和凋亡的影响及机制研究

谢闺娥， 杜晶春，徐　霞，董桂兰

(1.广州医科大学 金域检验学院，广东 广州 510182；2.广州大学 门诊部，广东 广州 510006)



扁蒴藤素对人乳腺癌MCF-7细胞生长和凋亡的影响及机制研究

谢闺娥1， 杜晶春1，徐霞1，董桂兰2

(1.广州医科大学 金域检验学院，广东 广州 510182；2.广州大学 门诊部，广东 广州 510006)

[摘要]目的研究扁蒴藤素对乳腺癌细胞MCF-7生长和凋亡的影响及其机制。 方法用MTT法检测扁蒴藤素对MCF-7细胞细胞生长的影响；用Annexin V-FITC/PI双染及TUNEL染色检测扁蒴藤素对MCF-7凋亡的诱导作用；用western blot分析扁蒴藤素作用后，凋亡相关因子Bcl-2和Bax蛋白的表达变化。 结果扁蒴藤素对MCF-7细胞的生长有显著的抑制作用，对其作用48 h的半数抑制浓度(IC50)为0.59 μmol/L。1.0 μmol/L扁蒴藤素作用后,Annexin V-FITC/PI染色凋亡细胞比率(15.55±1.43)%，TUNEL阳性的MCF-7细胞比率为(35.59±4.43)%，较对照组(未经扁朔藤素作用)[(1.45±0.24)%和(0.85±0.34)%]明显升高，差异均有显著性意义，P<0.05。Western blot结果显示，扁蒴藤素能下调Bcl-2的表达，上调Bax的表达。 结论扁蒴藤素素通过调节细胞凋亡相关因子诱导MCF-7细胞凋亡的发生，从而高效抑制MCF-7乳腺癌细胞的生长。

[关键词]扁蒴藤素；乳腺癌；MCF-7；凋亡

[引用本文]谢闺娥， 杜晶春，徐霞，等.扁蒴藤素对人乳腺癌MCF-7细胞生长和凋亡的影响及机制研究[J].大连医科大学学报，2016,38(3)：215-218.

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，发病率呈缓慢上升趋势，在许多西方国家中，乳腺癌的发病率占女性癌肿的首位[1]。化疗是治疗乳腺癌的重要辅助性手段，化疗能够明显降低乳腺癌的术后复发率，对晚期乳腺癌失去根治机会者采用化疗也有明显的缓解率。但是，多药耐药性的产生往往限制了常用化疗药物的使用[2]。

南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)，又名过山风、黄藤、降龙草、金银柳、穷搅藤、苦树皮、七寸麻、过山龙、地南蛇、老牛筋等，是卫矛科南蛇藤属植物。扁蒴藤素(Pristimerin)主要存在于南蛇藤的根皮中，研究表明其具有广谱抗肿瘤[3-8]、抗炎[8]、抗氧化[9]及其它多种药理活性。2008年扁蒴藤素被进一步证实，可通过抑制蛋白酶体活性而发挥抗肿瘤作用，是新型的蛋白酶体抑制剂[10]。其对乳腺癌的作用及其机制尚未完全明确。本研究以最常用的乳腺癌细胞系MCF-7为模型，探讨扁蒴藤素对MCF-7生长的影响及其可能的作用机制，以期为探索新的乳腺癌高效化疗药物提供实验依据。

1材料和方法

1.1主要材料与试剂

人乳腺癌MCF-7细胞系购自ATCC，扁蒴藤素、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶 (PI)购自美国Sigma公司；胎牛血清(FBS)为美国Hyclone公司产品；DMEM培养基、胰蛋白酶为美国Gibco公司产品；MTT购自美国Genview公司； Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、DeadEndTM Fluorometric TUNEL试剂盒购自美国Roche公司;BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光液购自美国Pierce公司；Bax和Bcl-2抗体购自美国Cell Signaling公司；鼠抗人GAPDH购自Sigma公司；HRP标记抗鼠二抗和 HRP标记抗兔二抗为Pierce公司产品。

1.2细胞培养

人乳腺癌细胞株MCF-7于含10%FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中，37 ℃，5%CO2饱和湿度孵箱内培养。传代用含0.02%EDTA的0.05%胰酶消化，以DMEM完全培养基终止消化。

1.3MTT比色法

取对数生长期的细胞，胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL；每孔种200 μL细胞悬液于96孔培养板内，培养24 h，吸去旧培养液，加入含不同浓度扁蒴藤素(设7个不同浓度：0.1、0.5、1、2.5、5、10和20 μmol/L)的培养基，同时设立对照组，正常培养基，每组均设3个平行孔培养；48 h，每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，培养4 h；小心吸弃培养基，加入100 μL DMSO置摇床上低速振荡10 min；酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其吸光度(OD)值，按下述公式计算生长抑制率：抑制率(%)=(1-OD加药组/ OD对照组)×100%，并用Bliss's软件计算半数抑制浓度(IC50)值[11]。

1.4Annexin V-FITC/PI染色

取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7，实验组加入扁蒴藤素终浓度为1.0 μmol/L的培养基，对照组加入正常培养基， 培养8 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，1×binding buffer悬浮细胞至1×106个/mL，取100 μL细胞悬液加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI，混匀，室温避光反应15 min；加入400 μL 1×binding buffer充分混合，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5TUNEL染色

将MCF-7细胞消化后计数，按每孔1.0×105个细胞分别接种至已铺有盖玻片的24孔细胞培养板中，培养过夜；实验组加入终浓度为1.0 μmol/L的扁蒴藤素，对照组正常培养，培养24 h，弃去培养基，加入4%多聚甲醛，4 ℃固定细胞25 min； PBS洗涤3次，每次5 min；用0.2% Triton X-100处理5 min；PBS洗涤3次，每次5 min；尽量吸去多余液体，滴加100 μL平衡缓冲液覆盖细胞，平衡5～10 min；配制rTdT反应缓冲液(45 μL Equilibration Buffer+5 μL Nucleotide Mix+1 μL rTdT Enzyme)/每孔；吸弃平衡缓冲液，将50 μL rTdT反应缓冲液滴加至细胞上，将24孔板放入湿盒中反应，37 ℃孵育1 h，注意避光(以下步骤均需)；吸弃反应液，加入2×SSC室温作用15 min以终止反应；室温下，PBS洗涤3次，每次5 min；加入1 μg/mL PI 室温下避光作用15 min；PBS洗涤3次，每次5 min；吸尽多余的水分，将盖玻片上的细胞避光干燥过夜，次日加Anti-Fade封片；在荧光显微镜下进行观察，TUNEL染色阳性荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

1.6Western blot实验

分别收集1.0 μmol/L的扁蒴藤素处理组和对照组MCF-7细胞，PBS洗涤后加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，经BCA法蛋白定量后，western blot法检测Bcl-2和Bax蛋白表达水平。制备SDS-PAGE胶，电泳，转膜。5%脱脂奶粉对PVDF膜进行封闭后，一抗4 ℃孵育过夜，洗涤后用HRP标记的二抗室温孵育1 h，再次洗涤后以ECL试剂盒发光、X线胶片感光显影后观察结果。GAPDH为内参照。

1.7统计学方法

采用SPSS 13.0进行数据处理及统计分析。数据均以均值±标准差表示，两组间的比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1扁蒴藤素对MCF-7细胞生长的影响

MTT比色结果表明，扁蒴藤素对MCF-7细胞的生长有显著的抑制作用，当药物浓度为1.0 μmol/L时，对MCF-7细胞的生长抑制率为73.88%，48 h的IC50为0.59 μmol/L。见图1。

图1　扁蒴藤素对MCF-7细胞生长抑制曲线Fig 1 Dose-response curve of pristimerin on the growth of MCF-7 cells

2.2扁蒴藤素对MCF-7细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI双染法结果显示，MCF-7细胞经扁蒴藤素作用8 h后，凋亡细胞比率(15.55±1.43)%较对照组(1.45±0.24)%明显升高，差异有显著性意义,P<0.05。见图2。

TUNEL结果显示，未经扁蒴藤素作用的对照组几乎未见TUNEL染色阳性细胞；经扁蒴藤素作用24 h后，TUNEL染色阳性细胞率(35.59±4.43)%较对照组(0.85±0.34)%明显增加，差异有显著性意义，P<0.05。见图3。

2.3扁蒴藤素对细胞凋亡相关因子的调节

Werstern blot分析表明，扁蒴藤素能够下调Bcl-2的表达，上调Bax的表达。见图 4。

图2　Annexin V-FITC/PI染色检测扁蒴藤素对MCF-7细胞的凋亡诱导作用Fig 2 Annexin V-FITC/PI staining of MCF-7 cells treated with pristimerinA: Annexin V-FITC/PI染色流式细胞分析图； B: 凋亡细胞比率统计图。 *与对照组比较，P<0.05

图3　TUNEL染色检测扁蒴藤素对MCF-7细胞的凋亡诱导作用

图4　扁蒴藤素对MCF-7细胞Bcl-2和Bax蛋白的影响Fig 4 Effect of pristimerin on the expression of Bcl-2 and Bax in MCF-7 cells

3讨论

作为发病率占女性癌肿首位的恶性肿瘤，乳腺癌严重威胁着女性的健康。临床上使用化疗药物进行治疗时，肿瘤对化疗药物的耐药性严重影响了治疗效果[2]。

作为药用南蛇藤的重要活性成分，扁蒴藤素能够抑制多种肿瘤细胞的恶性增殖[3-8]。而本实验研究了扁蒴藤素对乳腺癌MCF-7细胞生长和凋亡的影响，结果表明扁蒴藤素对MCF-7细胞的生长也具有很强的抑制作用。经扁蒴藤素作用后，Annexin V-FITC染色和TUNEL染色阳性的MCF-7细胞比例均增高，表明扁蒴藤素能诱导MCF-7细胞凋亡的发生。

为进一步探讨扁蒴藤素对肿瘤细胞可能的作用机制，对细胞凋亡相关因子的表达进行了检测。Werstern blot显示，扁蒴藤素显著减少了Bcl-2的表达，增加Bax的表达。Bcl-2、Bax都定位于线粒体膜上，Bcl-2基因家族与线粒体在细胞凋亡中的作用密切相关[12]；Bax是参与细胞凋亡的一个成员，可以直接促使细胞色素C在外膜未被破坏的情况下通过某种通道释放至胞浆，同时激发PT通道的开放，降低线粒体膜电位[13]。而Bcl-2蛋白则通过稳定线粒体膜电位，阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用。此外，Bcl-2的过度表达可引起细胞核谷胱甘肽的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低了Caspase的活性。因此，扁蒴藤素对抗凋亡蛋白Bcl-2的下调和对促凋亡蛋白Bax的上调作用可以部分解释扁蒴藤素诱导MCF-7细胞凋亡的机制。

扁蒴藤素能够下调Bcl-2、上调Bax的表达，从而激活细胞内凋亡途径，最终高效抑制MCF-7的生长。本研究扩充了对扁蒴藤素抗乳腺癌作用及其机制的新认识，也将为新的抗乳腺癌化疗药物的研发提供实验依据。

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基金项目:国家自然科学基金项目(81101682)；广东省公益研究与能力建设专项资金项目(2014A020212015)

作者简介:谢闺娥(1981-)，女，湖南邵阳人，讲师。E-mail：guier2003@126.com 通信作者:徐 霞，教授。E-mail：xux2014@126.com

doi:论著10.11724/jdmu.2016.03.02

[中图分类号]R737.9

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)03-0215-04

(收稿日期:2016-01-13;修回日期:2016-05-20)

Effect of pristimerin on the growth and apoptosis of MCF-7 breast cancer cells and the mechanism

XIE Gui-e1, DU Jing-chun1, XU Xia1, DONG Gui-lan2

(1.KingMedSchoolofLaboratoryMedicine,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China；2.OutpatientDepartment,GuangzhouUniversity,Guangzhou510006,China)

[Abstract]Objective To investigate the effect of pristimerin on the growth and apoptosis of MCF-7 breast cancer cells and to explore the underlying mechanism. Methods The effect of pristimerin on the growth and of apoptosis MCF-7 cells were analyzed by MTT assay and Annexin V-FITC/PI staining, TUNEL staining, respectively. The expression of Bcl-2 and Bax was determined by western blotting analysis. Results Pristimerin exhibited a marked inhibition on the survival of MCF-7 cells, and the half maximal inhibitory concentration (IC50) value was 0.59 μmol/L. The numbers of apoptotic MCF-7 cells, as revealed by Annexin V binding and TUNEL assay, increased upon pristimerin treatment. Pristimerin treatment resulted in a decrease of Bcl-2 and an increase of Bax expression. Conclusion Our results demonstrated that pristimerin suppressed the proliferation of MCF-7 cells, and that these effects occurred through increasing apoptosis by regulation of apoptotic effectors.

[Key words]pristimerin; breast cancer; MCF-7; apoptosis