大鼠miR-142-3p、miR-145-3p表达模式分析

吴慧，赵宇龙，王艳红，房兴堂，陈宏，张春雷



实验研究

大鼠miR-142-3p、miR-145-3p表达模式分析

吴慧，赵宇龙，王艳红，房兴堂，陈宏，张春雷

摘要：目的筛选并鉴定对大鼠乳腺发育和泌乳调控起关键作用的微RNAs（miRNAs）。方法以U6为内参基因，运用实时荧光定量PCR，比较miR-142-3p、miR-145-3p在泌乳21 d大鼠乳腺、肝、心、脾、肺、肾、卵巢、子宫各器官的组织样品表达量的差异及不同泌乳阶段（1、7、21 d）乳腺组织miR-142-3p、miR-145-3p的表达规律。结果miR-142-3p在泌乳21 d各组织的表达存在差异，乳腺中的表达量显著高于心、脾、肺、肾、卵巢和子宫，仅次于肝中的表达量（P＜0.05）。miR-145-3p在乳腺中的表达量显著高于肝、脾和肾，而在心、肺、卵巢和子宫中差异无统计学意义（P＞0.05）。乳腺组织在泌乳1、7、21 d比较，miR-142-3p的相对表达量持续下调，而miR-145-3p的相对表达量先下调后上调。结论miR-142-3p和miR-145-3p在大鼠各组织及不同生理时期存在表达差异；miR-142-3p可通过调节靶基因催乳素受体（Prlr）来调控乳腺的发育和泌乳的形成，miR-145-3p可能具有与miR-145、miR-145-5p相似的功能。

关键词：乳腺，动物；微RNAs；肝；心脏；脾；肺；肾；卵巢；子宫；大鼠，Sprague-Dawley；miR-142-3p；miR-145-3p；实时荧光定量PCR

母乳喂养是指用母亲的乳汁来哺养婴儿。母乳喂养有益于婴儿和母亲［1］。乳汁中的营养成分能促进婴儿的健康成长，其抗体可以提高婴儿免疫力［2］。此外，母乳喂养也利于母亲的产后康复。然而很多产妇患有生理性泌乳困难，对于这一问题的解决还存在空白。因此，对泌乳机制的深入研究势在必行。

微RNAs（microRNAs，miRNAs）是一类在转录后调节基因表达的非编码RNA。研究表明，miRNA在细胞增殖与分化、发育和凋亡、激素分泌、疾病发生等方面起着重要的调控作用［3］。目前，miRNAs多集中于乳腺疾病方面的研究［4］，其调控乳腺生长发育和泌乳的报道很少［5］。已有研究证实miR-142-3p可以调控乳腺上皮细胞的增殖和乳汁的合成［6］；而miR-145-3p通过靶向胰岛素受体激酶底物 1 （IRS1）来调控脂肪的合成［7］。本实验室已通过乳腺组织miRNA转录组测序，筛选出27个在乳腺中差异表达的miRNAs［8］。本研究以大鼠为模式动物，采用实时荧光定量PCR技术，对差异表达的miR-142-3p和miR-145-3p作进一步验证并分析泌乳期不同阶段miRNA的表达规律。

1　材料与方法

1.1实验样品实验所用Sprague Dawley大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，相同条件下喂养，快速取泌乳1、7 d活体（各5个生物学重复）的乳腺组织及21 d活体（3个生物学重复）的乳腺、肝、心、脾、肺、肾、卵巢、子宫组织，于-80℃保存备用。

1.2主要试剂与仪器总RNA抽提试剂盒Trizol、反转录试剂盒［PrimeScript®RT reagent Kit（Perfect Real Time）］、荧光定量PCR试剂盒［SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）］均购于宝生物工程有限公司。台式超低温冰箱（德国Kendro Laboratory）；凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）；紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Step One Plus型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.3引物的设计与合成大鼠miR-142-3p的反转录、荧光定量PCR引物通过Primer Premier 6.0软件设计，并由上海生工有限公司合成。miR-145-3p、U6基因的反转录、荧光定量PCR引物购自Life Technology公司，miR-142-3p引物序列见表1。

Tab.1　The base sequences of primers for quantitative real-time PCR and reverse transcription表1　反转录和荧光定量PCR和反转录引物序列

1.4总RNA提取和反转录取0.1 g组织样品，于预冷的研钵中加液氮研磨组织至粉末，加入1 mL Trizol，按总RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA。总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外分光光度计检测总RNA的浓度和纯度，将提取的RNA保存于-80℃备用。按照反转录试剂盒说明书进行反转录。

1.4.1总RNA中基因组DNA的去除2 μg总RNA，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL gDNA Eraser，RNase Free dH2O补加至10 μL，PCR仪中42℃2 min。

1.4.2cDNA的合成上述反应液10 μL中加入1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1 μL RT Primer Mix，4 μL 5× PrimeScript Buffer 2，4μL RNase Free dH2O，总体积为20μL。混匀后37℃15 min，85℃5 s，反应结束后将cDNA放于-20℃备用。

1.5TaqMan探针法实时荧光定量PCR按照Takara公司的（SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ）试剂盒说明书进行操作，反应在Step One Plus荧光定量PCR仪上进行。反应体系（20 μL）：10 μL Probe Master，1 μL Primer Mix，1.5 μL cDNA模板，7.5 μL超纯水。其中Primer Mix的配置方法：TaqMan探针（10 μmol/L）1 μL，上、下游引物（10 μmo/L）各7.5 μL，超纯水9 μL。95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，重复40个循环；并进行熔解曲线分析。每个组织样品做3次平行试验，取其平均值，并在每批次实验中设阴性对照。采用2-ΔΔCt法分析表达量，2-ΔΔCt越大说明miRNA在组织中的表达越强。ΔΔCt=（Ct实验目的基因-Ct实验管家基因）-（Ct对照目的基因-Ct对照管家基因），计算得到ΔΔCt值后再计算2-ΔΔCt值。

1.6靶基因预测和GO（Gene Ontology）分析首先利用Target scan6.2预测miR-142-3p、miR-145-3p的靶基因，将预测出的靶基因分别映射到GO数据库（DAVID）中，根据假阳性率＜0.05和富集参数＞1.3，筛选出符合要求的基因本体分类条目。

1.7统计学方法实验数据采用SPSS 17.0软件分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1总RNA提取结果总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示有28 S、18 S及5.8 S 3条带，28S、18S条带清晰；经紫外分光光度计检测，OD260/OD280=1.8～2.0，OD260/OD230＞2.0，表明RNA的浓度及完整性较好，可以用于后续实验。

2.2大鼠 miR-142-3p组织表达谱分析大鼠miR-142-3p在各组织中的相对表达量（2- Ct均数±标准差）从高到低分别为肝、乳腺、肺、心、脾、卵巢、子宫和肾，且乳腺中的表达量显著高于心、脾、肺、肾、卵巢和子宫，仅次于肝中的表达量（F=327.748，P＜0.05），见图1。

2.3大鼠 miR-145-3p组织表达谱分析大鼠miR-145-3p在各组织中的相对表达量（2- Ct均数±标准差）从高到低分别为心、乳腺、肺、子宫、卵巢、肝、脾和肾，且乳腺中的表达量显著高于肝、脾和肾，而在心、肺、卵巢和子宫中差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

Fig.1　Histograms showingthe relative expression differences of miR-142-3p in different tissues at day 21 of lactation图1　泌乳21 d大鼠各组织中miR-142-3p的相对表达差异图

Fig.2　Histograms showingthe relative expression differences of miR-145-3p in different tissues at day 21 of lactation图2　泌乳21 d大鼠各组织中miR-145-3p的相对表达差异图

2.4大鼠miR-142-3p和miR-145-3p在不同泌乳阶段的相对表达谱（REP） 结果显示，miR-142-3p的表达呈持续下降趋势；miR-145-3p的表达先下调后上调，见图3。

Fig.3　Expression profiles of miR-142-3p and miR-145-3p in different lactation stages图3　miR-142-3p和miR-145-3p在不同泌乳阶段的表达谱

2.5靶基因的预测和GO分析miR-142-3p的GO分析结果表明样本在富集的功能上多集中于正调控大分子代谢过程、调控凋亡等；miR-145-3p的 GO分析结果表明样本在富集的功能上多集中于正调控催化活性、突出神经元、调控信号转导通路等，见图4。

Fig.4　GO analysis of miR-142-3p and miR-145-3p图4　miR-142-3p和miR-145-3p GO分析图

3　讨论

乳腺的发育和泌乳是一个极其复杂、高度综合的过程，不仅受到激素、蛋白的调控，同时受到细胞因子、miRNA等的调控。miRNA主要通过与靶基因结合来调控乳导管和腺泡的发育、乳腺上皮细胞的活性［9］和增殖分化、乳蛋白合成［10］及乳糖代谢［11］。

miR-142-3p与miR-145-3p预测的靶基因中，其中Prlr［6］、IRS1、β-酪蛋白基因（CSN2）［12］等已被证实在乳腺发育和泌乳中发挥重要的调控作用。miR-142-3p与miR-145-3p的表达在大鼠各组织中存在差异，miR-142-3p在大鼠的乳腺、肝中表达丰度较高，进一步说明miR-142-3p参与乳腺生长发育的调控和乳脂的合成，这与李慧铭［6］的研究结果miR-142-3p通过靶向Prlr抑制乳腺上皮细胞的增殖和降低β-酪蛋白的分泌一致。miR-145-3p在乳腺、心、肺脏、卵巢和子宫中均高表达，表明其对生长发育、繁殖性能、呼吸系统等均起生物学作用，这与一个miRNA通过靶向多个靶基因，如髓细胞组织增生致癌基因（c-Myc）、八聚体结合蛋白-4（OCT4）等，参与多条信号通路途径而发挥功能的结果相一致［13］。

Wang等［14］对小鼠乳腺不同发育阶段miRNA进行研究发现，乳腺每一个发育阶段都有它自己的miRNA表达谱，即在乳腺中的表达呈现时间特异性。miR-142-3p在泌乳1、7、21 d中表达下调。miR-142-3p通过抑制内源性Prlr基因和蛋白的表达［6］，来调控mTOR和JAK2/STAT5信号通路，进而抑制乳腺上皮细胞的活性、增殖能力及β-酪蛋白的分泌［15］。本研究中miR-142-3p在泌乳7 d的表达量急剧下降，说明此时乳腺上皮细胞的活性、β-酪蛋白的分泌能力很强。Lei等［16］研究报道，miR-145通过抑制钙离子相关的RhoA1蛋白（ROCK1）的mRNA来抑制细胞增殖、侵袭和转移，从而促进细胞的凋亡。Guo等［7］研究显示miR-145-5p通过靶向胰岛素受体能抑制脂肪的形成。本研究表明，miR-145-3p在泌乳7 d表达量最低，泌乳21 d呈明显上升，推测miR-145-3p与miR-145、miR-145-5p功能相同似。

综上所述，miRNA在乳腺组织发育和泌乳中发挥重要作用，但对其具体调控机制尚不清楚。因此，研究miRNA对正常乳腺发育和泌乳的调控具有重要意义，同时也为人类乳腺疾病的诊治提供新思路。

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（2015-08-20收稿2015-11-10修回）

（本文编辑李鹏）

The expression pattern of miR-142-3p and miR-145-3p in rat tissues

WU Hui，ZHAO Yulong，WANG Yanhong，FANG Xingtang，CHEN Hong，ZHANG Chunlei
School of Life Science of Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，China Corresponding AuthorE-mail:clzhang@jsnu.edu.cn

Abstract：ObjectiveTo screen and identify the key miRNAs during mammary gland development and milk secretion of rats.MethodsGene U6 was taken as interior label gene by real time-PCR to compare the differences of expression levels of miR-142-3p and miR-145-3p in the mammary gland，liver，heart，spleen，lung，kidney，ovary and uterus after 21 postpartum. Moreover，the expressions of miR-142-3p and miR-145-3p in different stages（1，7 and 21 d）of lactation were summarized. ResultsThere was significant difference in miR-142-3p in lactation 21 d between different tissues.The expression of miR-142-3p was significantly higher in mammary gland than that in heart，spleen，lung，kidney，ovary and uterus tissues，which was second only to the expression in liver（P＜0.05）.The expression of miR-145-3p was significantly higher in mammary gland than that in liver，spleen and kidney.There was no significant difference in the expression of miR-145-3p between heart，lung，ovary and uterus（P＞0.05）.Furthermore，the relative expression level of miR-142-3p was continuing downward continued to decline in breast at different stages of lactation，while the relative expression level of miR-145-3p was up-regulated after downregulating.ConclusionmiR-142-3p and miR-145-3p are differentially expressed in different tissues and physiological periods in rats.In addition，miR-142-3p can regulate the growth of mammary gland and the formation of lactation by targeting prolactin receptor（Prlr），miR-145-3p may have the same function with miR-145 and miR-145-5p.

Key words：mammary glands，animal；microRNAs；liver；heart；spleen；lung；kidney；ovary；uterus；rats，Sprague-Dawley；miR-142-3p；miR-145-3p；real time-PCR

中图分类号：R349.6

文献标志码：A

DOI：10.11958/20150116

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31472077）

作者单位：江苏师范大学生命科学学院（邮编221116）

作者简介：吴慧（1989），女，硕士研究生，主要从事乳腺分子生物学研究

通讯作者E-mail：clzhang@jsnu.edu.cn