GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53联合测定在结直肠癌中的表达及应用研究*

钟纬经詹雪乳陈广峰



GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53联合测定在结直肠癌中的表达及应用研究*

钟纬经①詹雪乳①陈广峰①

【摘要】目的：探讨结直肠癌组织中正谷胱甘肽-S-转移酶-π（GST-π）、DNA拓扑异构酶（TopoⅡ）、P-糖蛋白（P-gp）、Ki-67抗原（Ki-67）及P53基因（P53）的表达及临床意义。方法：选取2014年1月-2015年6月本院收治的术前未做化疗的24例结直肠癌患者作为研究对象，根据预后情况将其分为预后生存＜1年组8例和预后生存＞1年组16例，分析GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53表达与临床病理特征的关系，比较两组患者GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表达阳性率。结果：24例结直肠癌患者，GST-π表达阳性9例（低度表达7例，中度表达2例），TopoⅡ表达阳性23例（低度表达15例，中度表达8例），P-gp表达阳性23例（低度表达8例，中度表达15例），Ki-67表达阳性24例（低度表达3例，中度表达11例，高度表达10例），P53表达阳性10例（低度表达3例，中度表达3例，高度表达4例）。预后生存＞1年组GST-π、P53的表达阳性率均为12.5%，显著低于预后生存＜1年组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05），而在TopoⅡ、P-gp、Ki-67方面比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：联合检测GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表达有助于结直肠癌早期发现及评估患者预后，值得临床推广。

【关键词】结直肠癌； 生物标志物； 表达； 联合检测； 预后

①广东省肇庆市中医院 广东 肇庆 526020

First-author’s address：Traditional Chinese Medicine Hospital of Zhaoqing City，Zhaoqing 526020，China

结直肠癌是消化道系统常见的恶性肿瘤之一，随着肿瘤生物标记物研究的深入，大量研究证实，正谷胱甘肽-S-转移酶-π（GST-π）、DNA拓扑异构酶（TopoⅡ）、P-糖蛋白（P-gp）、Ki-67抗原（Ki-67）、P53基因（P53）在结直肠癌患者的表达与健康体检者存有差异，为结直肠癌的早期诊断、早期治疗提供了依据［1-3］。但是，流行病学调查显示，虽然其早期诊断准确率提高，但是结直肠癌患者术后5年生存率较低，而随着对肿瘤标记物认识的加深，发现GST-π、TopoⅡ等可能与结肠癌的形成、发展及预后密切相关［4］。本研究选取2014年1月-2015年6月本院收治的24例结直肠癌患者作为研究对象，应用免疫组化法检测其结直肠癌组织的GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表达，分析其表达与临床病理特征的关系，旨在为结直肠癌临床诊断、治疗及预后判断提供依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月-2015年6月本院收治的术前未做化疗的结直肠癌患者24例作为研究对象，所有患者均有完整的随访资料，经病理证实均为腺癌，排除结直肠癌家族史、其他组织或器官的恶性肿瘤、严重精神疾病或依从性较差者。其中男13例，女11例；年龄42～84岁，平均（63.41±7.69）岁；肿瘤直径1.2～8.5 cm，平均（4.76±1.08） cm；其中结肠癌12例，直肠癌12例；病理类型：黏液腺癌1例，息肉状管状、乳头状腺癌1例，管状、绒毛状腺瘤伴黏膜内癌1例，管状、绒毛状腺瘤局部黏膜重度不典型增生（黏膜内癌变）1例，乳头状腺癌1例，小细胞神经内分泌癌1例，中低分化2例，中分化15例，高分化1例；淋巴结转移15例，未转移9例。根据预后将其分为两组，预后生存＞1年组16例中，男9例，女7例；年龄42～80岁，平均（62.5±8.07）岁；预后生存＜1年组8例中，男4例，女4例，年龄47～84岁，平均（64.3±7.48）岁。两组患者性别、年龄等方面比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 仪器与材料 鼠抗人单克隆抗体GST-π（克隆号LW29）、TopoⅡ（克隆号3F6）、P-gp（克隆号C494）、Ki-67（克隆号MIB-1）、P53（克隆号DO-7）及即用型免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒、3，3’-二氨基联苯胺（DAB）显色剂均购自于福州迈新公司。石蜡组织切片机（LICA2245型）。

1.3 方法 制作结直肠癌组织石蜡切片9张，其中1张用于常规HE染色，其余8张用于免疫组化及备用。应用免疫组化检测GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表达，各项操作严格按试剂盒说明书进行，批内变异＜6.0%。一般流程：（1）切片室温脱蜡2次，以不同浓度酒精梯度脱苯、水化各3 min，以自来水冲洗3 min，PBS浸泡2次；（2）切片置入3%过氧化氢溶液，孵育15 min，PBS浸泡2次；（3）加入一抗，置入4 ℃冰箱过夜；（4）PBS浸泡2次；（5）加入二抗，室温下孵育10～15 min；（5）PBS浸泡2次；（6）滴入DAB显色液，显色4～10 min后以自来水水洗；（7）经复染、盐酸酒精分化、返蓝后封片并判断结果。结果选择10个高倍镜视野计算阳性比例，分级标准：阴性指无阳性细胞染色；弱阳性指阳性细胞1%～25%；阳性指阳性细胞26%～50%；强阳性指阳性细胞＞50%。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用 X2检验，多组多分类资料采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表达及与临床病理特征的关系 24例患者中，GST-π表达阴性15例，阳性9例（低度表达7例，中度表达2例）；TopoⅡ表达阴性1例，阳性23例（低度表达15例，中度表达8例）；P-gp表达阴性1例，阳性23例（低度表达8例，中度表达15例）；Ki-67表达阴性0例，阳性24例（低度表达3例，中度表达11例，高度表达10例）；P53表达阴性14例，阳性10例（低度表达3例，中度表达3例，高度表达4例）。GST-π表达与分化程度有关（P＜0.05），TopoⅡ表达与发病部位有关（P＜0.05），P-gp表达与性别有关（P＜0.05），Ki-67表达与与肿瘤大小有关（P＜0.05），P53表达与发病部位有关（P＜0.05），见表1。GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53免疫组织化学染色结果见图1。2.2 两组不同指标表达阳性率比较 预后生存＞1年组结直肠癌患者GST-π、P53的表达阳性率均为12.5%，明显低于预后生存＜1年组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05），而两组TopoⅡ、P-gp、Ki-67方面比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67和P53的表达及与临床病理特征的关系 例

图1 GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53免疫组织化学染色结果

表2 两组不同指标表达阳性率比较 例（%）

3 讨论

结直肠癌是恶性程度高的消化道肿瘤之一，流行病学调查显示，其在我国人群中的发病率高达（20～30）/万人次，严重威胁着患者生命安全。随着结直肠的基础和临床研究的进步，提高了结直肠癌的早期诊断准确度，但是由于肿瘤细胞耐药性导致结直肠癌的化疗疗效并不理想［5-7］。近年来，随着分子生物学的发展，从癌基因、抑癌基因及肿瘤耐药基因研究癌症的发病原因、发病机制、治疗措施选择及影响预后的因素等成为临床关注的热点［8-11］。

GST-π是GST五个亚形中与肿瘤关系最密切的，其具有谷胱甘肽结合位点和一个亲电子物质结合位点，能够催化谷胱甘肽与化学药物、亲电性化合物结合降低化疗药物细胞毒性，且能够与亲电性药物结合促进药物外排，导致肿瘤细胞对化疗药物，如阿霉素、顺铂等产生耐药性［12］。TopoⅡ作为拓扑异构酶抑制剂，能够调节核酸空间结构动态变化，其高表达使肿瘤复制加快，增加肿瘤的恶性程度，同时其还是胺丫啶、蒽环类和鬼臼毒素等药物的靶蛋白，活性降低会使抗癌药的靶点减少或丧失，与多药耐药性密切相关［13］。P-gp由多药耐药基因1编码产生，其作为ATP结合盒转运蛋白超家族的一员，通过药物转运泵模式、疏水性真空清除泵模式将化疗药物从细胞内泵到细胞外，降低细胞内药物浓度，其表达程度与耐药程度成正比［14-15］。此外，P53基因被认为是与人类肿瘤相关性最高、突变最频发的一种基因，其突变型作为致癌基因会促进细胞恶性转化、增殖，而Ki-67蛋白被认为是检测肿瘤细胞增殖动力学的最佳指标，其表达可诊断和预测肿瘤对治疗的敏感度及其结局。

本研究24例结直肠癌患者中，GST-π表达阴性15例，阳性9例，TopoⅡ表达阴性1例，阳性23例，P-gp表达阴性1例，阳性23例，Ki-67表达阴性0例，阳性24例，P53表达阴性14例，阳性10例，与文献［6］报道相一致。对GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表达与临床病理特征的关系进行研究，结果显示GST-π表达与肿瘤分化程度有关，TopoⅡ表达与年龄、发病部位有关，P-gp表达与年龄、性别有关，Ki-67与肿瘤大小有关，P53与发病部位有关。因此，联合检测GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53可以有效评估结直肠癌自然病程、恶性程度等。预后生存＞1年组结直肠癌患者GST-π、P53的表达阳性率均为12.5%，明显低于预后生存＜1年组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。提示各肿瘤标志物介导的耐药谱或者敏感谱不同，因此联合检测其在结直肠癌中的表达有助于判断耐药情况与预后。但两组TopoⅡ、P-gp、Ki-67比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。考虑是由于样本量较少，患者个体差异较大，本研究仅为初步探索，需要更大样本量的研究来得出一个更为稳定和确切的结论。

综上所述，联合检测GST-π、TopoⅡ、P-gp、Ki-67及P53的表达有助于结直肠癌早期发现和评估患者预后。

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Expression and Application of GST-π，TopoⅡ，P-gp，Ki-67 and P53 Joint Determination in Colorectal Cancer

ZHONG Wei-jing，ZHAN Xue-ru，CHEN Guang-feng.//Medical Innovation of China，2016，13（12）：001-004

【Abstract】Objective：To investigate the expression and its clinical significance of GST-π，TopoⅡ，P-gp，Ki-67and P53 in colorectal cancer tissue.Method：A total of 24 cases of colorectal cancer who had not been treated before surgery in our hospital from January 2014 to June 2015 were selected as the research objects，they were divided into the prognosis survival less than 1 year group with 8 cases and the prognosis survival more than 1 year group with 16 cases according to the prognosis，the relationship between GST-π，TopoⅡ，P-gp，P53，Ki-67 expression and clinical pathological features were analyzed and the positive expression rate of GST-π，TopoⅡ，P-gp，P53，Ki-67 were compared.Result：For 24 cases of colorectal cancer，GST-πexpression was positive in 9 cases （low expression in 7 cases，moderate expression in 2 cases），TopoⅡ expression was positive in 23 cases （low expression in 15 cases，moderate in 8 cases），P-gp expression was positive in 23 cases （low expression in 8 cases， moderate in 15 cases），Ki-67 expression was positive in 24 cases （low expression in 3 cases，moderate in 11 cases，highly expressed in 10 cases），P53 expression was positive in 10 cases （low expression in 3 cases，moderate in 3 cases，highly expressed in 4 cases）.The prognosis survival more than 1 year group of GST-π and P53 expression positive rate was all 12.5%，significantly lower than that of the prognosis survival less than 1 years group，the differences were statistically significant（P＜0.05），and there were no significant differences in TopoⅡ，P-gp and Ki-67（P＞0.05）.Conclusion：Combined detection of GST-π，P-gp，TopoⅡ，Ki-67 and P53 contribute to colorectal cancer early diagnosis and evaluate the prognosis of patients，it is worthy of clinical promotion.

【Key words】Colorectal cancer； Biomarker； Expression； Combined detection； Prognosis

*基金项目：肇庆市科技创新计划项目（2014E289）

通信作者：钟纬经

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.12.001

收稿日期：（2015-12-01） （本文编辑：李颖）