应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒的价值探讨

姚秀林

（辽宁省抚顺市疾病预防控制中心，辽宁 抚顺 113006）



应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒的价值探讨

姚秀林

（辽宁省抚顺市疾病预防控制中心，辽宁 抚顺 113006）

【摘要】目的 研究探讨实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒的临床应用价值。方法 选取2015年4～9月在抚顺市中心医院收治因食物或怀疑由食物引起的感染性或中毒性就诊病例82例，均通过采集患者粪便提取病毒RNA，并结合基因Ⅱ型诺如病毒特点采取荧光定量RT-PCR技术及常规RT-PCR进行检测。结果 通过实时荧光定量RT-PCR方式对感染性或中毒性患者进行诺如病毒筛查诊断，其诊断检出率明显高于常规RT-PCR方式。结论 采取实时荧光定量RT-PCR检测基因Ⅱ型诺如病毒具有良好的特异性与敏感度，可针对病毒标本浓度不同进行定量检测，并能够对诺如病毒疑似疫情或病例的快速鉴别诊断。

【关键词】实时荧光定量；RT-PCR技术；检测；基因Ⅱ型诺如病毒

诺如病毒属于杯状病毒之一，同时也是当前非细菌类急性胃肠炎疾病主要致病源，可在医院、学校、餐馆等人群密集地爆发急性胃肠炎，通过对诺如病毒不断研究发现，人群致病诺如病毒大致分为GⅠ、GⅡ、GⅣ3个基因型，其中统计表明当属GⅡ型诺如病毒最为高发［1］。过去临床中对于诺如病毒的检测多是通过酶联免疫吸附实验ELISA或逆转录-聚合酶链反应RT-PCR进行诊断，但其操作方式较为复杂、耗时长、易产生交叉污染等因素不利于临床广泛性筛查，并且在检出率也尚有不足。而近几年发展的实时荧光定量RT-PCR技术则通过定量检测病毒，一步完成等优势广泛应用。为进一步探讨实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒的价值，通过对收集的感染性或中毒性病例样本进行不同方式对照检测，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取2015年4～9月在抚顺市中心医院收治因食物或怀疑由食物引起的感染性或中毒性就诊病例82例，主要临床表现为恶心、呕吐、腹痛和腹泻（排便≥3次/天）且粪便性状异常（稀水样便、黏液便、脓血便）。均通过直接采集8～10 g粪便样本置于-70 ℃环境下保存待检。

1.2 病毒RNA提取方法：取粪便样本2 g加入无菌液震荡稀释呈10%悬液，并8000 r/min离心5 min，静置取上清液100 μL，参照QIAGEN RNeasy Mini Kit提取试剂说明书进行病毒RNA提取，并存放与-70 ℃环境冰冻保存。

1.3 实时荧光定量RT-PCR：cDNA合成：采用江苏硕世生物科技有限公司生产扩增试剂为诺如病毒GⅡ核酸检测试剂盒说明书配置RT-PCR反应液。反应体系配置：RT-PCR反应液7.5 μL，酶混合液5 μL，诺如病毒GⅡ反应液4 μL，去RNA酶水3.5 μL，病毒核酸/RNA 5 μL。PCR反应检测诺如病毒GⅡ型采用引物COG2F/G2-SKR。反应条件：50 ℃ 30 min→95 ℃ 5 min预变性→95 ℃ 10 s变性55 ℃ 40 s退火、延伸及检测荧光45cycle检测通道：FAM、VIC。将具有反应的病毒RNA样品建立3个不同浓度，均采取实时荧光定量RT-PCR检测，并均采取五次重复性反应，结合变异系数验证方法的重现性。

2 结 果

2.1 实时荧光定量RT-PCR反应重复性：通过对不同浓度的3个具有反应的病毒RNA样品采取定量PCR检测，并均重复性检查5次，通过计算同一样本Ct值的差异来验证方法的准确性，见表1。

表1 荧光定量RT-PCR检测诺如病毒的重复性

2.2 实时荧光定量RT-PCR技术与常规RT-PCR方法检测结果：通过对82例患者粪便标本病毒RNA分别采取实时荧光定量RT-PCR技术与常规RT-PCR方法检测，其结果表明实时荧光定量RT-PCR技术呈阳性标本检出率显著高于常规RT-PCR方法，详见表2。

表2 实时荧光定量RT-PCR技术与常规RT-PCR方法检测结果

3 讨 论

诺如病毒基因亚型种类复杂切庞大，并具有极高的变异性，因此在采取PCR技术检测中，需针对病毒敏感度、特异性指标针对病毒RNA进行研究并探讨出较为广谱的引物是极为重要的。目前临床中RT-PCR方法在检测中多将ORF1的聚合酶区段与ORF2的壳蛋白区段作为关键性引物与探针进检测反应［2］，而国外学者Kageyama［3］通过针对诺如病毒RNA特点，选择ORF1-ORF2交界处的N/S结构域设计，其引物具有良好的稳定性与保守度，尤为适用于诺如病毒基因分型诊断，其研究结果发现实时荧光定量RT-PCR技术在该项引物反应中具有良好的敏感性和特异性。诺如病毒在爆发感染后往往具有发病迅速、传播范围广，特性消失早等问题，在面临临床诊断时就要求需在短时间内对巨大数量样品性准确分析检测，其实时荧光定量RT-PCR技术相比与常规RT-PCR技术具有更为突出的检测敏感性及特异性，同时前者可采取闭管操作避免样品交叉感染风险，降低了假阳性污染的顽弊，提升检测质量及效率。并且在荧光探针的作用下增加检测灵敏度，简化操作步骤，无需重复实施酶切分析、探针杂交或序列测定等方式来明确验证结果。总之实时荧光定量RT-PCR较为适用于对诺如病毒疑似疫情或病例的快速鉴别诊断，值得临床应用。

参考文献

［1］ 李志凯，苏国成，苏文金，等.诺如病毒检测方法研究进展［J］.微生物学通报，2014，41（7）:1417-1424.

［2］ 夏体娇，金敏，陈照立，等.荧光定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型方法的建立和评估［J］.解放军预防医学杂志，2013，31（3）:200-203.

［3］ Kageyama T，Koji ma S，Shinohara M，et al.Broadlyreactive and highlysensitive assayfor Norwalk-like viruses based on real-ti me quantitative reverse transcription-PCR［J］. J Clin Microbiol，2003，41（4）:1548-1557.

中图分类号：R45

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）03-0179-01