应用SERS滤纸基底检测饮料中违禁色素的研究

林 爽，哈斯乌力吉*，林 翔，韩斯琴高娃，娄秀涛，林殿阳*，吕志伟*

1. 哈尔滨工业大学可调谐(气体)激光技术国家级重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080 2. 内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028007

应用SERS滤纸基底检测饮料中违禁色素的研究

林 爽1，哈斯乌力吉1*，林 翔1，韩斯琴高娃2，娄秀涛1，林殿阳1*，吕志伟1*

1. 哈尔滨工业大学可调谐(气体)激光技术国家级重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080 2. 内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028007

利用液/液界面自组装技术制备得到灵敏度高、均匀性好、价格低廉的表面增强拉曼光谱(SERS)滤纸基底，并使用该基底检测了饮料中可能掺杂的罗丹明B、日落黄和柯衣定等三种色素。首先分析了罗丹明B、日落黄和柯衣定的分子结构并对其进行了拉曼特征峰峰位归属； 然后检测了罗丹明B、日落黄和柯衣定不同浓度水溶液的SERS光谱； 最后在无任何预处理条件下，检测了饮料中的罗丹明B、日落黄和柯衣定含量。在一定浓度范围内，饮料中三种色素的浓度与其SERS特征峰强度分别满足一定的函数关系，其中罗丹明B和日落黄的浓度与拉曼特征峰强度之间呈非线性关系，而柯衣定的浓度与拉曼特征峰强度之间呈线性关系。评估了本方法检测饮料中的罗丹明B、日落黄、柯衣定的信号重复性及检测回收率，结果表明SERS方法可用来对饮料中罗丹明B、日落黄、柯衣定的浓度进行半定量分析。为饮料中添加色素的现场实时检测提供了一种简便快速高效的检测方式，可用于饮料的质量控制及市场监控。

表面增强拉曼光谱(SERS)； 违禁色素； SERS滤纸基底； 饮料

引 言

色素能够使饮料的颜色变得鲜艳，使其对消费者更具吸引力，因此被广泛应用于饮料加工和制造中。近年来，涉及违禁色素使用方面的食品安全问题频繁发生，这使得消费者以及社会更加关注色素安全问题。目前，世界各国关于于色素对人体健康的影响都有大量的研究，饮料中添加过量的食用色素或者直接添加违禁色素，都会对人体健康产生严重的威胁。因此，对于饮料中添加色素各国都有着严格的管理和使用标准。目前，检测饮料中添加色素的方法主要有液相色谱法、分光光度法、层析法、薄层色谱法以及极谱法等等[1, 2]。然而这些方法中，有些需要大型的仪器设备以及复杂的样品预处理过程，无法保证检测的灵敏度以及均匀性，还有一些方法受到的干扰严重、准确度不高[3]，因此现在市场上急需一种高灵敏度、快速、便捷的现场实时检测食品中色素的方法。

表面增强拉曼光谱(SERS)是一种新兴的和极具发展前景的检测技术，SERS技术使用金、银等金属纳米粒子可以大幅度提高常规拉曼光谱的灵敏度，从而能够检测食品中添加的微量污染物[4-6]。表面增强拉曼光谱因具有灵敏度高、光谱带窄、水干扰小等优点，而广泛地应用于食品、材料、医学等各个领域[7-9]。同时表面增强拉曼光谱技术可以使用便携式拉曼光谱仪，无需大型的仪器设备，这为食品检测领域实现快速实地检测提供了必要条件。SERS基底主要由纳米粗糙度的金属表面构成，因此金属材料的纳米制备技术对SERS基底尤为关键[10, 11]。制备灵敏度高、重现性、稳定性好以及制备方法简单的SERS基底，对于SERS技术用于食品检测等领域具有重要的应用意义[12, 13]。SERS技术将分子指纹的特异性与单分子灵敏度结合，近年来已成为一个具有巨大潜力的检测工具，广泛应用于生物化学分析以及食品、医疗等领域中分子的痕量检测。

通过制备出的简便、价格低廉的SERS滤纸基底，利用SERS技术对饮料中的三种色素进行检测，从而完善和补充国家食品安全监管体系，更好地提高饮料的安全性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

实验所用硝酸银(≥99.8%)、柠檬酸钠(≥99.0%)、罗丹明B、日落黄、柯衣定和四丁基硝酸铵均购于国药集团化学试剂有限公司，二氯甲烷购于天津博迪化工股份有限公司，定量中速滤纸购于杭州新华纸业有限公司。饮料样品购于当地食品商店。实验中所用水均为去离子水。

1.2 SERS滤纸基底的制备

首先根据Lee和Meisel的方法制备银溶胶[14]。制备步骤为： 将45 mg硝酸银溶入250 mL水中并煮沸，随后向其中加入5 mL 1%的柠檬酸钠溶液，整个过程匀速搅拌煮沸1 h。自然冷却至室温，于4 ℃环境下避光储存。

SERS滤纸基底的制备流程参考文献[15]，取4 mL银溶胶于离心管中，加入2 mL的二氯甲烷，剧烈振荡。然后加入适量的四丁基硝酸铵，直到界面处形成明显的银纳米颗粒薄膜。再移除部分水和二氯甲烷，最后利用涂覆的方法将银纳米颗粒薄膜吸附在2 cm×2 cm的滤纸上，在烘干箱中避光烘干。

1.3 三种色素标准水溶液的配制

称取0.1 g罗丹明B粉末，溶解于100 mL去离子水中制成罗丹明B 10-3g·mL-1水溶液，依次逐级稀释，制备其5×10-5，10-5，5×10-6，10-6，5×10-7，10-7，10-8g·mL-1浓度的罗丹明B水溶液。

日落黄与柯衣定水溶液制备方法与罗丹明B相同。空白样品为水溶液。

1.4 掺杂色素加标饮料样品的配制

以市售美年达橙味碳酸饮料为样品。首先将样品饮料搅拌并加热，将饮料中的二氧化碳蒸发出去，然后分别取不同浓度的色素水溶液1 mL，加入至9 mL饮料样品中，制备出相应溶度掺杂色素加标饮料样品。利用SERS滤纸基底分别检测其拉曼光谱。空白样品为未掺杂的饮料样品。

1.5 拉曼检测

实验采用BWS415-785H型(B&W Tek, Inc.)便携式拉曼光谱仪采集光谱。激发光波长785 nm，光谱测量范围为175～2 700 cm-1，光谱分辨率小于3 cm-1。数据采集及光谱处理均采用光谱仪自带软件Bwram 1.01.20。使用Boxcar平滑方法对采集到的光谱进行平滑处理，并使用软件自带指令对光谱数据进行背景扣除。

2 结果与讨论

2.1 SERS滤纸基底的电镜图和实物图

单层吸附的液/液界面自组装银纳米颗粒SERS滤纸基底的实物和电镜照片如图1所示。

SERS滤纸基底上银纳米颗粒分布比较均匀，银纳米颗粒在滤纸上的覆盖率大约为90%，几乎没有银纳米颗粒相互团簇在一起。根据Image J软件计算分析得到，SERS滤纸基底上银纳米颗粒的平均尺寸为(50±4)nm。

2.2 不同浓度罗丹明B、日落黄和柯衣定水溶液的SERS

罗丹明B的结构式如图2(a)所示。根据文献[16]，基于密度泛函理论，罗丹明B的理论计算拉曼光谱中拉曼特征峰主要位于1 195，1 275，1 356，1 506，1 525，1 644 cm-1等处。其中1 195 cm-1对应于C—H弯曲振动，1 275 cm-1对应于甲基的摇摆振动，1 356，1 506，1 525和1 644 cm-1对应于氧杂蒽环的伸缩振动。将15 μL制备好的梯度浓度罗丹明B水溶液滴在不同的滤纸基底上，分别检测其SERS光谱[图2(b)]。

图1 SERS滤纸基底的电镜图A和实物图B

图2 (a)罗丹明B的分子结构，(b)不同浓度 的罗丹明B水溶液的SERS光谱图

Fig.2 Molecular structure of RB (a)，SERS spectra of RB aqueous solution with different concentrations (b)

由图2(b)可以看出，罗丹明B水溶液的SERS光谱在1 355, 1 504, 1 644 cm-1的特征峰十分明显，而且不会受到其他物质特征峰的干扰，因此选此三处的特征峰为研究对象。浓度为10-8g·mL-1的罗丹明B的拉曼光谱中仍可看到特征峰，因此对水溶液中罗丹明B的检测限可以达到10-8g·mL-1。

日落黄的结构式如图3(a)所示。根据文献[17]使用密度泛函理论(DFT)进行计算和归属，日落黄的拉曼光谱中较强的特征峰主要位于1 092，1 174，1 228，1 330，1 380，1 494，1 593 cm-1，其中1 228 cm-1对应C—C—R1键的面内变形振动、C—N键的伸缩振动以及C—C—R2键的伸缩振动，1 494 cm-1对应C—N键、C—O键的伸缩振动以及N—H键的摇摆振动，1 593 cm-1对应C—C—R1键的伸缩振动以及C—H—R1键的摇摆振动。将15 μL制备好的梯度浓度日落黄水溶液滴在不同的滤纸基底上，分别检测其SERS光谱[图3(b)]。

如图3(b)所示，随着日落黄水溶液浓度的降低，日落黄在1 593 cm-1处的特征峰强度也随之降低。当浓度为10-6g·mL-1时，仍然可以在拉曼光谱中看到明显的特征峰，因此，利用SERS滤纸基底检测日落黄水溶液，检测限可以达到10-6g·mL-1。

图3 (a)日落黄的分子结构，(b)不同浓度 的日落黄水溶液的SERS光谱图

Fig.3 Molecular structure of sunset yellow (a)，SERS spectra of sunset yellowaqueous solution with different concentrations (b)

图4 (a)柯衣定的结构图，(b)不同浓度 的柯衣定水溶液的SERS光谱图

Fig.4 Molecular structure of chrysoidine (a)，SERS spectra of chrysoidineaqueous solution with different concentrations (b)

图4(b)显示，利用SERS滤纸基底检测柯衣定水溶液，10-7g·mL-1柯衣定水溶液在1 004 cm-1有非常强的特征峰，而5×10-8g·mL-1柯衣定水溶液在1 004 cm-1处也有明显的拉曼信号，因此采用SERS方法检测柯衣定水溶液的下限可达5×10-8g·mL-1。

2.3 掺杂违禁色素加标饮料样品的SERS以及半定量分析

2.3.1 掺杂违禁色素罗丹明B饮料样品的SERS以及半定量分析

为检测在实际样品饮料中添加的违禁色素，为实际应用奠定基础，利用SERS滤纸基底检测制备好的掺杂不同浓度违禁色素罗丹明B的加标饮料样品，每组样品测量5次求平均[图5(a)]。

图5 不同浓度的罗丹明B饮料样品的SERS光谱图(a),罗丹明B浓度与1 644 cm-1特征峰强度的关系(b)

Fig.5 SERS spectra of RB in drink with different concentrations(a)，the relationship between the Raman intensity at peak of 1 644 cm-1and RB concentrations in drink (b)

从图5(a)中可以看出，罗丹明B在1 355，1 504，1 644 cm-1的特征峰有明显的拉曼信号，表明SERS技术能够快速、灵敏地检测饮料中的违禁色素罗丹明B。同时，当浓度低至10-6g·mL-1，依然可以在SERS光谱图中看到特征拉曼信号，检测限可以达到10-6g·mL-1。说明SERS滤纸是性能良好的SERS基底，可以检测到更低浓度饮料中的违禁色素。此外，也表明SERS技术可以高效地检测实际饮料样品中的微量罗丹明B，同时无需任何预处理，检测方法快速、简单，容易实现，可以应用到饮料中的罗丹明B的现场检测。

以1 644 cm-1处的拉曼特征峰为分析对象，罗丹明B的拉曼强度与饮料中罗丹明B的浓度之间的函数关系如图5(b)。相关系数为0.957，表明拟合曲线具有较高的准确性。

可靠的回收率是检测方法能否走向实际应用的关键[18-20]。为验证此检测方法的可靠性和准确性，通过检测了掺杂罗丹明B的加标饮料样品来测定该检测方法的回收率。选择了7.5×10-5g·mL-1，2.5×10-5g·mL-1，2.5×10-6g·mL-1三个浓度梯度，对于每个浓度的加标饮料样品，检测3次后求平均。根据拟合曲线以及拉曼特征峰1 644 cm-1处的强度值，计算出饮料中罗丹明B的浓度，并且计算出此方法的回收率以及相对标准偏差(RSD)(表1)。

表1 利用SERS技术检测饮料中罗丹明B的回收率以及相对标准偏差

如表1所示，利用SERS滤纸基底检测饮料中的罗丹明B，这种检测方法的回收率在98.6%～105.3%的范围内，而且RSD都小于5%。以前的研究利用其他方法，如固相萃取检测饮料中的罗丹明B，回收率为96%～118%，而且需要比较复杂和耗时的预处理流程。然而SERS滤纸基底不但具有较高的灵敏度和回收率，保证了方法的高效性和准确性，同时无需任何预处理，检测流程更加简单、快速和方便，对于现场实时地检测饮料中的罗丹明B具有很大的实际价值。

2.3.2 掺杂违禁色素日落黄饮料样品的SERS以及半定量分析

为检测饮料中添加的日落黄，更好地对饮料中添加的日落黄进行监管，研究了饮料中添加不同浓度(10-2～10-4g·mL-1)日落黄的检测，SERS滤纸基底在饮料中日落黄的检测中取得了良好的效果。

图6(a)显示，对于饮料中掺杂的色素日落黄，当浓度达到10-4g·mL-1时，在相应的SERS光谱中日落黄特征峰处拉曼信号依然很明显，表明利用SERS滤纸基底检测饮料中的日落黄检测限可以达到10-4g·mL-1。而我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760—1996)中规定，日落黄用于饮料时最大使用量0.10g·kg-1(相当于10-4g·mL-1)，因此SERS方法用于饮料中日落黄的检测能够满足国家的标准，具有重要的实际应用价值。

对于半定量分析，应该选取具有稳定强度的拉曼特征峰，以确保半定量分析的可靠性。因此选定日落黄1 593 cm-1特征峰为研究对象，拟合了饮料中日落黄的浓度与相应拉曼峰强度之间的函数关系，如图6(b)所示。相关系数为0.982，说明拟合曲线具有较好的准确性。

图6 不同浓度日落黄饮料样品的SERS光谱图(a), 饮料中日落黄浓度与1 593 cm-1特征峰强度的关系(b)

Fig.6 SERS spectra of sunset yellow in drink with different concentrations (a)，the relationship between the Raman intensity at peak of 1 593 cm-1and sunset yellow concentrations in drink (b)

为计算此检测方法对于检测饮料中日落黄的回收率，选择三个掺杂浓度点，分别为7.5×10-3，2.5×10-3，2.5×10-4g·mL-1。对于每个浓度，以SERS滤纸基底检测三个重复的拉曼光谱。利用拉曼光谱中1 593 cm-1处特征峰的强度，结合拟合获得的关系曲线，得到计算浓度以及相应的回收率(表2)。

表2 利用SERS技术检测饮料中日落黄的回收率以及相对标准偏差

表2显示，利用SERS方法检测饮料中的日落黄的回收率在94.9%～105.4%之间，RSD都小于5%，说明本检测方法具有较好的可靠性。

2.3.3 掺杂违禁色素柯衣定饮料样品的SERS以及半定量分析

浓度10-4～ 10-6g·mL-1的掺杂违禁色素柯衣定饮料样品的具有指纹特性的SERS光谱如图7(a)所示，饮料中的违禁色素柯衣定可以有效地通过SERS滤纸基底检测。对于饮料中的柯衣定，以1 004 cm-1的拉曼特征峰作分析对象，拟合出饮料中柯衣定的浓度与拉曼特征峰强度的函数关系，如图7(b)所示。

图7 掺杂不同浓度的柯衣定的饮料样品的SERS光谱图(a), 饮料中柯衣定浓度与拉曼特征峰1 004 cm-1处强度的函数关系(b)

Fig.7 SERS spectra of chrysoidine in drink with different concentrations (a)，the relationship between the Raman intensity at peak of 1 004 cm-1and chrysoidine concentrations in drink (b)

图7(a)显示，掺杂柯衣定饮料样品的SERS光谱中，明显的拉曼特征峰仍在1 004 cm-1处。而当浓度为10-6g·mL-1时，仍可以观察到拉曼信号，说明SERS滤纸基底检测饮料中掺杂的柯衣定，检测限可以达到10-6g·mL-1。图7(b)显示，随着饮料中柯衣定浓度的增加，SERS光谱中1 004 cm-1的特征峰相对强度也随之线性增加。线性区域在10-4～10-6g·mL-1，在线性区域内，饮料中柯衣定浓度与拉曼特征峰强度显示了很好的线性关系，相关系数为0.922。这一趋势与检测罗丹明B和日落黄时并不相同，这一现象在其他文献中也多有发现[21]。分析认为此现象可能与SERS基底的特性及待测分子在基底表面的吸附方式有关。

利用相同的方法，计算得到了利用SERS方法检测饮料中添加柯衣定的回收率(表3)。回收率的范围在92.6%～108.1%，相对标准偏差小于5%。

表3 利用SERS技术检测饮料中柯衣定的回收率以及相对标准偏差

3 结 论

以液/液界面自组装银纳米颗粒滤纸作为SERS活性基底，检测了违禁色素罗丹明B、日落黄和柯衣定的SERS光谱。利用SERS滤纸基底对水溶液中的罗丹明B、日落黄和柯衣定进行了SERS检测，得到最低检测限分别为5×10-8，10-6和10-8g·mL-1。同时检测了实际食品基质饮料中添加的罗丹明B、日落黄和柯衣定，最低检测限可分别达到10-6，10-4和10-6g·，mL-1。由于无需任何预处理，利用SERS技术检测饮料中的违禁色素流程简单、方便和快速，该检测方法在饮料中违禁色素的现场快速检测中具有巨大的潜力。而且在一定的浓度范围内，饮料中的违禁色素浓度与相应的拉曼特征峰强度满足一定的函数关系，计算得到了SERS方法检测饮料中的违禁色素的回收率，较高的回收率和较低的相对标准偏差表明，此方法具有极好的可靠性和准确性，可以用来对饮料中添加的违禁色素浓度进行半定量分析。本方法操作容易、快捷高效，在饮料中的快速实地检测方面具有独特的优势。

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(Received Apr. 17, 2015; accepted Aug. 16, 2015)

*Corresponding authors

Study on Detection of Prohibited Pigments in Drinks Using Paper-Based SERS Substrates

LIN Shuang1, Hasi Wuliji1*, LIN Xiang1, Han Siqingaowa2, LOU Xiu-tao1, LIN Dian-yang1*, LÜ Zhi-wei1*

1. National Key Laboratory of Science and Technology on Tunable Laser, Harbin Institute of Technology, Harbin 150080, China 2. Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028007, China

In this paper, a novel paper-based Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrate with high sensitivity, good uniformity and popular price is developed via liquid/liquid interface self-assembly technique. Three pigment, rhodamine B, sunset yellow and chrysoidine were detected through paper-based SERS substrates using a portable Raman spectrometer. The structures of the three pigments were investigated and vibrational modes of characteristic peaks of three pigments were assigned. SERS spectra of rhodamine B, sunset yellow and chrysoidine in aqueous solution with different concentrations were detected respectively. Rhodamine B, sunset yellow and chrysoidine in drinks were also detected in drinks without any pretreatment. Within a certain range of concentrations, it meets certain function. For rhodamine B and sunset yellow, the relationship between concentration and Raman peak intensity is on an index curve, while for chrysoidine, the relationship is linear. In addition, high recoveries are achieved for detecting rhodamine B, sunset yellow and chrysoidine in drinks, which indicated our method is suited for semi-quantitative analysis for the concentration of rhodamine B, sunset yellow and chrysoidine in drinks. Surface-enhanced Raman spectroscopy provides an easy approach to fast and efficient detection for multiple pigments in drinks and can be used for quality control and market monitoring of drinks.

SERS; Prohibited pigment; Paper-based SERS substrate; Drink

2015-04-17，

2015-08-16

国家国际技术合作专项项目(2011DFA31770)资助

林 爽，女，1990年生, 哈尔滨工业大学航天学院硕士研究生 e-mail： lin808208@163.com *通讯联系人 e-mail: hasiwuliji@126.com; dianyanglin@hit.edu.cn; zw_lu@sohu.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)06-1749-06