乳菇和红菇的红外光谱及其二维相关红外光谱的分析与鉴别

马殿旭, 刘 刚, 欧全宏, 于海超, 李会梅，刘 艳

云南师范大学物理与电子信息学院, 云南 昆明 650500

乳菇和红菇的红外光谱及其二维相关红外光谱的分析与鉴别

马殿旭, 刘 刚*, 欧全宏, 于海超, 李会梅，刘 艳

云南师范大学物理与电子信息学院, 云南 昆明 650500

采用傅里叶变换红外光谱原始谱、二阶导数光谱以及二维相关谱的三级鉴定方法，对红菇属和乳菇属六种蘑菇进行了鉴别分析。六种样品的原始光谱吸收峰非常相似，主要为蛋白质和碳水化合物的吸收组成，但在各样品吸收峰强度、峰形和峰位上仍有微小差异。对其进行二阶导数分析，在二阶导数谱中，1 800～1 400和1 200～800 cm-1范围内的吸收峰强度、位置、峰形状显示出明显差异。二维相关红外光谱提高了光谱的分辨率； 对六种蘑菇样品进行二维相关红外光谱分析，发现在1 690～1 420 cm-1范围内，三种乳菇出现了3个明显的自动峰，另外三种红菇出现了4个自动峰，而且自动峰和交叉峰位置、强度均不同； 在1 110～920 cm-1二维光谱范围内，六种蘑菇的自动峰和交叉峰的数量、位置和强度也都不同； 说明不同样品中蛋白质和糖类化合物的显著不同。结果表明： 应用红外光谱、二阶导数谱和二维相关红外光谱三级鉴定的技术可以快速有效地分析和鉴别辣乳菇、绒白乳菇、香乳菇、稀褶红菇、变绿红菇和近似酒红菇。该多级鉴定的方法对于分类鉴别蘑菇是一种快速、准确、有效的方法。

乳菇属； 红菇属； 蘑菇； 傅里叶变换红外光谱； 二维相关红外光谱

引 言

红菇科隶属于真菌系担子菌亚门(Basidiomycotina)层菌纲(Hymenomycetes)伞菌目(Agaricales)，其有2个重要的属，红菇属(Russula)和乳菇属(Lactarius)[1]。红菇科的种类大多是世界广布种，分布在温带地区，常生于林中地上，通常与松属、冷杉属以及壳斗目等植物形成外生菌根，成为林木生长不可缺少的因子[2]。该科除了许多种类可供食用、或药食兼用外，有的种类还对肿瘤具有抑制作用[3]，是筛选、提取抗癌药物的重要对象之一，具有极高的营养价值和药用价值。选取了红菇科中的辣乳菇、绒白乳菇、香乳菇、稀褶红菇、变绿红菇和近似酒红菇进行研究。

红菇科菌种类多，其中也包含较多毒蘑菇，因此快速准确地鉴别菌属对自然资源的开发、利用、保护和物种多样性研究等有重要意义。但目前对该菌属的鉴别研究更多是通过外观、形态和特征来区分，存在一定的主观性。而傅里叶变换红外光谱技术具有不破坏真菌样品化学结构，能定性或定量的反映出真菌的组成物质，具有用量少操作简单等优点。二维相关红外光谱引入了外界微扰，将光谱信号扩展到第二维上以提高光谱分辨率。其在中草药检验鉴别、食物品质检测、分子结构变化等的技术领域已经获得了很好的应用： 如Choong等[4]用红外光谱和二维相关红外光谱对商业产品灵芝的检验； Popescu等[5]采用二维相关红外光谱对真菌降解椴木的过程进行了研究； Lei等[6]用傅里叶红外光谱结合二维相关红外光谱对奶粉中的结晶乳糖含量进行了分析检测； Tian等[7]利用二维相关红外光谱对戊二醛链接的胶原蛋白的热稳定性进行了研究。我们采用傅里叶变换红外光谱结合二维相关红外光谱技术的指纹鉴定方法对红菇科的六种不同蘑菇进行鉴别研究。

1 实验部分

1.1 仪器与测试条件

红外光谱仪为Perkin Elmer公司生产的Frontier型傅里叶变换红外光谱仪，装备DTGS探测器，测定范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为16次。变温附件为EUROTHERM 3216型温控仪，测试温度范围50～120 ℃。

1.2 样品制备和光谱数据预处理

六种野生蘑菇均采自云南大理苍山。将六种样品烘干保存待测，实验时将样品放入玛瑙研钵中磨为细粉，再加入适量的溴化钾搅磨均匀，然后压片待测。使用红外光谱数据处理软件(OMNIC 8.0)对所采集的红外光谱进行基线校正、5点平滑、归一化预处理，利用 Origin 8.5软件进行原始、二阶导数光谱数据处理。并采用清华大学分析中心设计的二维相关分析软件进行二维相关光谱处理。

2 结果与讨论

2.1 六种乳菇和红菇的红外光谱特征

图1 六种不同乳菇和红菇的FTIR光谱

2.2 六种乳菇和红菇的二阶导数光谱特征

六种红菇和乳菇的原始光谱差异不大，而二阶导数光谱具有更高的分辨率，能够显示更多的分子信息[8]。选取1 800～1 400和1 200～800 cm-1范围的红外光谱进行二阶导数处理(图2，图3)，选用Savitsky-Golay方法。从图看出它们之间的主要区别如下： 图2中六种样品在1 744，1 650，1 544和1 454 cm-1附近二阶导数谱差异明显。在1 744 cm-1处香乳菇、稀褶红菇、变绿红菇和近似酒红菇均出现了吸收峰，其中稀褶红菇和近似酒红菇吸收强度最强，而辣乳菇和绒白乳菇未出现； 在1 650 cm-1附近绒白乳菇、稀褶红菇和变绿红菇出现了两个中等强度的吸收峰，而辣乳菇出现三个微弱的吸收峰，香乳菇和近似酒红菇均出现一个相对强的吸收峰，并且吸收峰的形状和强度有较大差别，说明它们所含的氨基酸多肽类化合物是不一致的； 1550 cm-1附近香乳菇出现两个吸收峰，其他样品均出现了一个明显的吸收峰； 1 454 cm-1附近样品的吸收峰峰形和峰强度均有明显差别，在1 468 cm-1处稀褶红菇和近似酒红菇出现了肩峰，而且稀褶红菇、变绿红菇和近似酒红菇的峰形较为相似。

图2 六种不同乳菇和红菇1 800～1 400 cm-1内的二阶导数光谱

Fig.2 Second derivative infrared spectra of six different species of lactarius and russula mushrooms in 1 800～1 400 cm-1

a: Lactarius piperratus;b: Lactarius vellereus;

c: Lactarius camphoratus;d: Russula nigricans;

e: Russula virescens;f: Russula cf.vinosa

图3 六种不同乳菇和红菇1 200～1 800 cm-1内的二阶导数光谱

Fig.3 Second derivative infrared spectra of six different species of lactarius and russula mushrooms in 1 200～800 cm-1

a: Lactarius piperratus;b: Lactarius vellereus;

c: Lactarius camphoratus;d: Russula nigricans;

e: Russula virescens;f: Russula cf.vinosa

图4 六种不同乳菇和红菇1 420～1 690 cm-1内的二维相关红外光谱

图5 六种不同乳菇和红菇1 110～920 cm-1内的二维相关红外光谱

在二阶导数谱1 200～800 cm-1范围内(图3)，1 085 cm-1吸收峰附近除近似酒红菇外的样品均出现了1 095 cm-1的吸收峰。在1 045 cm-1附近香乳菇和近似酒红菇只出现一个峰，而其他样品均出现两个峰； 在953 cm-1处香乳菇和变绿红菇吸收峰相对较强，辣乳菇和稀褶红菇吸收峰较弱，而绒白乳菇和近似酒红菇吸收峰近消失； 890 cm-1处近似酒红菇的吸收峰最弱，且辣乳菇的吸收峰平移了5个波数，在885 cm-1处； 这些差异说明六种样品本身所含的糖苷类化合物有差异，因此从二阶导数谱图差异中可以对红菇和乳菇进行区分。

2.3 六种乳菇和红菇的二维相关红外光谱特征

二维相关红外光谱分析是利用不同的外界微扰，研究体系各组分有关基团分子振动行为的差异，简化含有许多重叠峰的复杂光谱，阐明官能团之间的各种相互作用，从而可获得一维红外及其导数谱所不能获得的许多信息，提高了图谱分辨率[8-11]。对样品的红外光谱进行二维相关红外光谱处理，得到1 420～1 690和920～1 110 cm-1的二维相关红外同步光谱如图4和图5所示，2D-IR光谱表明： 六种样品的自动峰和交叉峰差异很大。图中等高线所形成的红色相关强度峰为正相关峰，等高线所形成的蓝色相关强度峰为负相关峰。按照二维相关光谱理论，同步谱是关于主对角线对称的谱图，处于主对角线位置上的峰，是动态红外光谱信号自身相关而得到，称为自动峰，自动峰总是正峰，它们代表了样品中各化学基团对热微扰的敏感程度，对热微扰越敏感，自动峰强度越强[9]。位于非主对角线位置处的峰称为交叉峰，交叉峰的出现说明在官能团之间可能存在着分子内或分子间的相互作用，表示两个相应频率的光谱强度变化的相似性，当两个独立波数处的动态红外信号彼此相关或者负相关时，就会出现交叉峰，交叉峰有正峰和负峰之分，当两个不同官能团在温度变化过程中振动方向一致时，出现一对正交叉峰； 如果两个不同官能团在温度变化过程中振动方向相反，则出现一对负交叉峰[10-14]。

图4为六种红菇和乳菇在1 420～1 690 cm-1范围的二维相关光谱，在辣乳菇、绒白乳菇和香乳菇的二维相关光谱中出现明显的3个自动峰，辣乳菇在1 649，1 550和1 468 cm-1处，其中1 649 cm-1的自动峰最强； 绒白乳菇和香乳菇出现在1 649，1 556，1 460 cm-1处，其中绒白乳菇在1 649和1 460 cm-1处的自动峰最强，而香乳菇最强的自动峰在1 460 cm-1处。各自动峰之间形成了正交叉峰，其辣乳菇明显的正交叉峰是(1 468, 1 649 cm-1)和(1 550, 1 649 cm-1)； 而绒白乳菇和香乳菇正交叉峰都在(1 460, 1 649 cm-1)，(1 556, 1 649 cm-1)和(1 460, 1 556 cm-1)处，绒白乳菇交叉峰(1 460, 1 649 cm-1)最强。在稀褶红菇、变绿红菇和近似酒红菇中出现了四个自动峰，分别都在1 649，1 619，1 556和1 460 cm-1处，在稀褶红菇中1 649和1 556 cm-1自动峰最强，1 619 cm-1最弱，变绿红菇中1 649和1 460 cm-1最强，1 619 cm-1最弱，而近似酒红菇中最强的自动峰出现在1 556 cm-1处，1 460和1 649 cm-1都相对较弱，1 619 cm-1几乎消失； 在稀褶红菇和变绿红菇中都出现了六个明显正交叉峰(1 460, 1 649 cm-1)，(1 460, 1 619 cm-1)，(1 556, 1 649 cm-1)，(1 556, 1 619 cm-1)，(1 460, 1 556 cm-1)和(1 649, 1 619 cm-1)，且强弱存在明显差异； 而近似酒红菇中只出现三个正交叉峰(1 460, 1 649 cm-1)，(1 556, 1 649 cm-1)和(1 460, 1 556 cm-1)，其强度都相对较弱。因此六种红菇和乳菇不仅在自动峰上的强度存在明显的差别，而且在交叉峰中正交叉峰的强度、位置都存在显著的区别。

在920～1 110 cm-1范围内，如图5，辣乳菇二维相关光谱中出现了4个明显的自动峰，分别是1 080，1 018，948，929 cm-1，其中1 018 cm-1处的自动峰最强，948和929 cm-1相对较弱。绒白乳菇、香乳菇、变绿红菇和稀褶红菇均出现3个自动峰，绒白乳菇和稀褶红菇出现在1 089，1 029，929 cm-1处，其最强自动峰均出现在1 089 cm-1处，稀褶红菇自动峰1 029 cm-1明显强于绒白乳菇； 香乳菇和变绿红菇则出现在1 089，1 019，929 cm-1处，其自动峰1 089 cm-1最强，1 019和929 cm-1次之，但自动峰1 019 cm-1变绿红菇明显强于香乳菇。近似酒红菇出现了2个相对较强自动峰，分别是1 080和1 039 cm-1。各自动峰之间相互形成了正交叉峰。但是1 069 cm-1处和各自动峰形成负交叉峰，说明对应的官能团是沿着相反方向振动变化。由以上分析可知，自动峰的位置、数目、相对峰强度和交叉峰的正负均有很大的差异，说明四者的糖苷类基团对温度的敏感程度是不一致的，进一步证明了六种样品本身所含的糖类化合物的不同。所以根据样品自动峰的数目、位置和交叉峰正负的差异能够实现这六种蘑菇的鉴别。

3 结 论

利用红外光谱技术结合二阶导数谱和二维相关红外光谱技术对六种乳菇和红菇样品进行三级鉴定分析。结果表明： 六种乳菇和红菇中主要成分为蛋白质和碳水化合物，以碳水化合物居多； 二阶导数谱和二维相关红外光谱提高光谱分辨率，使六种样品的差异更突出，样品能够得到准确鉴别； 并利用此多级鉴定的方法可对其中所含有成分进行定性和相对含量分析。而高分辨率的二阶导数谱和二维相关红外光谱可以很好地区分一维红外光谱较相似的样品。

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(Received Apr. 10, 2015; accepted Aug. 20, 2015)

*Corresponding author

Discrimination of Lactarius and Russula Mushrooms with FTIR and Two-Dimensional Correlation Infrared Spectroscopy

MA Dian-xu, LIU Gang*, OU Quan-hong, YU Hai-chao, LI Hui-mei, LIU Yan

School of Physics and Electronic Information, Yunnan Normal University, Kunming 650500, China

Tri-step infrared spectroscopy method of Fourier transform infrared spectroscopy, second derivative infrared spectroscopy and two-dimensional correlation infrared spectroscopy was firstly used to discriminate six species of mushrooms belonging to the genus Lactarius and Russula. The absorption bands of the original spectrum were very similar, which were composed by protein and polysaccharides, but tiny differences were observed at the position, shape and absorption intensities of peaks. Second derivative infrared spectroscopy technology was applied to study 6 species of the samples, there were obvious differences in the range of 1 800～1 400 and 1 200～800 cm-1. Two-dimensional correlation infrared spectroscopy can improve the resolution of spectra. Therefore two-dimensional correlation infrared spectroscopy was used to study 6 kinds of mushrooms. The results showed that there are three auto-peaks in the Lactarius, four in the Russula and significant differences in the number, intensity of auto-peaks and cross peaks were observed in the range of 1 690～1 420 cm-1. In addition, the peaks quantity, position, intensity of auto-peaks and cross peaks were different in the range of 1 110～920 cm-1. It demonstrates that tri-step infrared spectroscopy technology of Fourier transform infrared spectroscopy, second derivative infrared spectroscopy and two-dimensional correlation infrared spectroscopy is a rapid and effective method for discriminating Lactarius and Russula.

Lactarius; Russula; Mushroom; FTIR; Two-dimensional correlation infrared spectroscopy (2D-IR)

2015-04-10，

2015-08-20

国家自然科学基金项目(30960179)和云南省高校科技创新团队支持项目资助

马殿旭, 1991年生, 云南师范大学物理与电子信息学院硕士研究生 e-mail: 465615292@qq.com *通讯联系人 e-mail: gliu66@163.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)07-2104-07