仔猪回肠绒毛M细胞的形态、分布及其与猪流行性腹泻病毒感染的关系

李任峰，田香勤，乔松林，郭军庆，周恩民，张改平

(1.河南科技学院动物科学学院，新乡 453003；2.农业部动物免疫学重点实验室，河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，郑州 450002；3.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002；4.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；5.新乡医学院河南省高等学校组织再生重点开放实验室，新乡 453003)



仔猪回肠绒毛M细胞的形态、分布及其与猪流行性腹泻病毒感染的关系

李任峰1，2，4，田香勤5，乔松林2*，郭军庆2，周恩民4，张改平3*

(1.河南科技学院动物科学学院，新乡 453003；2.农业部动物免疫学重点实验室，河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，郑州 450002；3.河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002；4.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；5.新乡医学院河南省高等学校组织再生重点开放实验室，新乡 453003)

摘要：为了探索新生仔猪回肠绒毛上皮是否存在M细胞以及自然感染条件下猪流行性腹泻病毒(PEDV)与回肠绒毛M细胞之间的关系。采用免疫荧光、免疫组化及形态学方法研究了正常情况下仔猪回肠绒毛M细胞的分布特点和形态学特征，以及自然感染条件下PEDV与仔猪回肠绒毛M细胞之间的关系。免疫荧光结果证实正常仔猪回肠绒毛上皮存在M细胞，沿隐窝至绒毛顶端上皮方向，M细胞的数量逐渐减少。电镜下，正常仔猪的回肠绒毛M细胞具有典型的M细胞特征。自然感染PEDV的仔猪回肠绒毛M细胞病变明显，在其顶膜、细胞质、细胞核及其上皮下层均观察到成簇的PEDV颗粒，而相邻的其他上皮细胞病变不明显，且细胞内没有观察到病毒粒子。以上研究结果表明，新生仔猪回肠绒毛上皮存在M细胞，在绒毛的不同位置其分布比例存在差异。仔猪回肠绒毛M细胞可能是PEDV入侵肠道的重要通道。

关键词：肠绒毛M细胞；新生仔猪；猪流行性腹泻病毒

M细胞(microfold cell)又称为微皱褶细胞，最早发现于人的集合淋巴结(Payer’S patehes，PP)上的滤泡相关上皮(follicle associated epithelium，FAE)，在孤立淋巴结、阑尾和胃肠道外的黏膜相关淋巴组织也存在M细胞[1]。小肠绒毛上皮中M细胞的报道仅见于小鼠[2]，猪(特别是新生仔猪)小肠绒毛上皮是否存在M细胞以及形态特征尚未见报道。

典型的M细胞刷状缘发育不良，以微皱褶代替微绒毛，基底面内陷形成腔室，顶部细胞质终末网不发达，细胞游离面的碱性磷酸酶活性较低[3]。M细胞主要以受体介导胞吞方式摄取抗原，并特异性地将抗原转运至位于其下的抗原递呈细胞(APC)进行识别、处理并激活淋巴细胞，继而启动肠道黏膜免疫应答。然而，M细胞独特的形态学结构也为许多肠道病原体的入侵提供了门户[4]。

近年来，猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)病在我国的许多猪场暴发，对我国的养猪行业造成了严重影响。该病对成年猪危害较轻，但7日龄以内的新生仔猪死亡率可达100%[5]。考虑到PEDV对新生仔猪的高致病性以及M细胞在病毒感染和黏膜免疫中的重要作用，本研究首先通过免疫荧光染色和形态学方法证实了新生仔猪回肠绒毛存在M细胞，报道其超微结构特征及其在绒毛不同位置的分布特点，并初步探索自然感染条件下PEDV与仔猪回肠绒毛M细胞的关系。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1组织样品试验所用正常回肠组织样品来自2日龄健康仔猪(长白、大白和杜洛克三元杂交猪)，样品分为两份：一份切成5 mm3的组织块后迅速放置于液氮内冷冻30 min，OCT包埋剂包埋，Leica冰冻切片机切片，片厚6 μm，-20 ℃丙酮中固定10 min，供免疫荧光染色用；另一份用4%戊二醛溶液固定4～12 h，之后进一步修块，切成1 mm×1 mm×2 mm的小块用于电镜样品制作。自然感染PEDV的仔猪回肠组织分别采用与以上相同的方法进行冰冻切片及电镜样品的制备，用于免疫组化染色及透射电镜观察。

1.1.2主要仪器和试剂透射电子显微镜(Hitachi，H-7500型)，扫描电子显微镜(FEI Quanta 200FEG)，超薄切片机(Leica，UC6型)；激光共聚焦显微镜(日本FV-1000 Olympus)；戊二醛，锇酸，丙酮，乙醇，Epon-812包埋剂，Mouse anti-cytokeratin18 (CK18)monoclonal antibody(clone CY90，Sigma，C8541)。

1.2免疫荧光及免疫组化染色

免疫荧光染色：取切片放于室温，复温水化后，5%羊血清室温封闭30 min，加入小鼠抗CK18单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜，加入FITC 标记山羊抗小鼠IgG(1∶50，北京中杉金桥生物技术有限公司，ZF-0312)，37 ℃孵育40 min。操作过程避光。除血清封闭后直接加入一抗外，其余过程中均用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次10 min。DAPI(碧云天生物公司，C1006)染细胞核，甘油封片后用激光共聚焦显微镜观察。

免疫组化染色：冷冻切片样品于室温复温水化，其他步骤参照小鼠二步法免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-6002)说明书进行。一抗(小鼠抗PEDV S蛋白单克隆抗体，Cat no：9191，MEDIAN Diagnostics Inc，Korea)按1∶100稀释，4 ℃冰箱过夜。镜下控制DAB显色5～15 min，常规脱水、透明、中性树胶封片，光镜下观察和采集图片。

1.3透射电镜及扫描电镜样品制备

透射电镜样品制作：将固定的组织样品用PBS洗涤4次，每次1 h；锇酸后固定1 h，PBS洗涤4次，每次15 min；然后依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%的丙酮梯度脱水，每次约10 min；树脂812浸透24 h，定向包埋聚合96 h，制作50 nm超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察、摄片。

扫描电镜样品制作：用0.1 mol·L-1，pH 7.0的PBS振荡漂洗样品三次，每次1 h；1%的锇酸溶液固定样品1 h，用0.1 mol·L-1，pH 7.0的PBS漂洗样品3次，每次15 min；乙醇溶液对样品进行梯度脱水处理，每种浓度处理20 min；100%的乙醇处理两次，每次20 min；乙醇与醋酸异戊酯的混合液(V/V=1/1)处理样品30 min，纯醋酸异戊酯处理样品1～2 h，临界点干燥、镀膜、观察。

2结果

2.1正常仔猪回肠绒毛M细胞的分布特征

免疫荧光染色结果显示，在仔猪回肠的绒毛上皮观察到CK18+细胞的存在，这些CK18+细胞以密集型和分散型两种形式镶嵌于回肠绒毛上皮之间。沿隐窝至绒毛顶端方向，CK18+细胞的数量逐渐减少。另外，在回肠的隐窝及腺上皮处也观察到CK18+细胞的存在(图1A)。

A.回肠中绒毛M细胞的CK18免疫荧光结果(白色箭头代表散在的M细胞，白色三角符号代表成簇的M细胞)；B.透射电镜下回肠绒毛M细胞超微结构(其中G表示杯状细胞，E为邻近的上皮细胞)；C、D 和E.不同倍数扫描电镜下回肠绒毛M细胞形态A.CK18 IFA of villous M cells in the ileum of piglets(white arrowheads and triangular symbols indicate diffuse and dense distribution of villous M cells，respectively)；B.The ultra-structural view of villous M cells in the ileum by transmission electron micrograph (G is a goblet cell and E indicate epithelial cells)；C，D and E.The morphology of ileal villous M cells in different magnifications by scanning electron micrograph.The scale bar for A is 100 μm and B is 5 μm；for C，D and E is 20 μm，10 μm and 5 μm，respectively图1　仔猪回肠绒毛M细胞的分布及形态Fig.1　The distribution and morphology of villous M cells in the ileum

2.2正常仔猪回肠绒毛M细胞的超微结构特征

透射电镜下，回肠绒毛M细胞在形态上呈现典型的袋状，细胞质电子密度较邻近上皮细胞低，使其具有较大的细胞质亮度。M细胞的顶端质膜微绒毛较少，细胞表面不含分泌成分，顶部细胞质中缺乏由微丝组成的终末网结构，细胞间通过连接复合体形成紧密连接。另外，M细胞细胞质内含有许多小的囊泡，但溶酶体较少。细胞核呈卵圆形，多位于细胞基底面(图1B)。

与邻近的其他绒毛上皮细胞相比，扫描电镜下，正常仔猪回肠绒毛M细胞表面质膜颜色较暗，多呈不规则的多角形，内嵌于周围上皮细胞之间，细胞表面微绒毛数量较少且较为短粗，这些较钝的微绒毛在细胞表面形成微弱的脊状突起及微皱褶结构(图1C、D、E)。

2.3PEDV自然感染后的病毒分布及其引起的回肠绒毛M细胞形态学变化

对疑似PEDV感染的2日龄仔猪进行病原学检测，RT-PCR结果显示该仔猪为PEDV阳性，且传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(GARV)检测结果均为阴性(图2A)。取其回肠组织进行免疫组化染色及超薄切片。免疫组化结果显示，PEDV颗粒主要以成簇的形式分布于仔猪回肠某些绒毛上皮细胞的细胞质中，这些被病毒感染的绒毛上皮细胞具有与M细胞相似的分布特征，在这些上皮细胞的顶端质膜、细胞核及其上皮下层也观察到PEDV的存在(图2B)。透射电镜观察结果显示，PEDV自然感染后的回肠上皮微绒毛部分脱落，M细胞发生肿胀甚至坏死，细胞器遭到严重破坏，线粒体、内质网等无完整的形态，细胞核肿大并出现移位(图2C)。M细胞的细胞质中含有明显聚集成团的病毒颗粒，其大小在100 nm左右，与PEDV颗粒大小相符，而在与M细胞邻近的其他上皮细胞形态结构较为完整，细胞质中未观察到病毒粒子的存在(图2D、E)。另外，在绒毛M细胞的下方(靠近基底部)观察到淋巴细胞及单核细胞浸润(图2F)。

A.RT-PCR检测结果；B.免疫组化显示分布于回肠某些绒毛上皮细胞顶膜(红色箭头)、细胞质(黄色箭头)，细胞核(绿色箭头)及其上皮下层(白色箭头)的PEDV颗粒；C.M细胞细胞核肿大并出现移位；D.M细胞的细胞器遭到破坏严重；E.较高放大倍数电镜观察结果(白色箭头所示为存在于M细胞细胞质中的PEDV)；F.绒毛M细胞下方存在淋巴细胞及单核细胞浸润A.The detection for PEDV by reverse transcription polymerase chain reaction.Lane M.2-kb DNA ladder；lane 1.PEDV positive，a 894 bp DNA fragment was amplified；lane 2，3.TGEV and GARV negative；lane 4.Double distilled water negative control；B.PEDV were shown presented on the apical membrane(red arrowhead)，in the cytoplasm(yellow arrowhead)，around the nucleus(green arrowhead) and subepithelial by immunohistochemical staining of PEDV S protein；C.The nucleus of villous M cells become swollen and displaced；D.The organelles of M cell were destroyed severely；E.PEDV particles were observed in the cytoplasm of M cell by higher magnification(white arrowheads indicate PEDV in the cytoplasm of M cell)；F.Some monocytes and lymphocytes were infiltrated under the villous M cells.The scale bar for B，C，D，E，and F is 100 μm，2 μm，1.0 μm，0.5 μm and 4 μm，respectively图2　PEDV自然感染后的病毒分布及其引起的回肠绒毛M细胞形态学变化Fig.2　The distribution of PEDV and morphological changes of piglet ileum villous M Cells with PEDV natural infection

3讨论

黏膜免疫系统是动物有机体抵抗病原微生物入侵的第一道免疫屏障，自20世纪60年代黏膜免疫的概念首次被提出以来，就一直受到国内外学者的关注。除极少数病原体通过节肢动物或其他动物的叮咬、注射、输血等途径入侵机体以外，绝大多数病原体都是通过黏膜入侵的[6]。M细胞是黏膜免疫系统的重要组成部分，研究M细胞在病原体跨越黏膜屏障中所发挥的作用，不但有助于进一步认识病原体的入侵机制，也为研究以M细胞为靶向的黏膜疫苗提供理论依据。

目前，大多数研究集中在关于淋巴结(圆顶区)中M细胞的形态及功能[7-8]。而对绒毛上皮中M细胞的研究相对缺乏。A.Gebert等认为，猪的M细胞主要存在于滤泡相关上皮的圆顶区(dome)，在与淋巴滤泡和圆顶区紧邻的肠绒毛上皮中偶尔发现M细胞的存在，而在远离圆顶区的猪肠绒毛上皮中不存在M细胞[9]。然而，本研究采用免疫荧光和形态学方法证实，新生仔猪小肠远离圆顶区的回肠绒毛上皮存在M细胞，且这些M细胞在绒毛的不同部位存在数量差异，这与之前的报道并不完全一致。

M细胞的形态在不同种类动物间既有共同之处，同时也存在差异，甚至同一动物不同部位也有差异[10]。人类肠道M细胞表面缺乏微绒毛，鼠M细胞表面的微绒毛短而不规则，而兔M细胞表面的微绒毛较其邻近肠上皮细胞上的微绒毛长。猪回肠内M细胞在隐窝上皮内大多数呈现柱状，并且从隐窝上皮到圆顶上皮内，M细胞的形态呈现出由柱状到“口袋状”逐渐转变[11]。另外，小鼠和人肠道PP结中的成熟M细胞呈圆顶状，细胞基底部向顶部(肠腔面)深陷，形成一个较大的中央腔，腔内含有丰富的淋巴细胞[12]。本研究利用透射电镜观察到新生仔猪回肠绒毛M细胞呈典型的袋状，但其基底面并没有形成典型的“拱状”结构，这可能与切片的方向、动物种属差异以及M细胞所处的不同部位和发育程度有关。另外，本研究同时对回肠的前段、中段和后段进行取材，但并没有观察到三部分之间存在明显的形态学差异。

不同种类动物体内M细胞具有特异的表面标志[13]。CK18作为猪的M细胞表面标志物已经得到证实[9]。本研究利用CK18的单克隆抗体进行免疫荧光试验，结果表明，仔猪回肠绒毛上皮存在M细胞，沿隐窝至绒毛顶端上皮方向，M细胞数量呈现逐渐减少的趋势。另外，作者在回肠的隐窝及腺上皮也观察到CK18+细胞的存在，这可能跟M细胞的起源及分化有关。有报道认为，M细胞可能起源于淋巴滤泡周围隐窝中的干细胞，沿隐窝至绒毛顶端上皮方向M细胞可能具有不同的分化和迁移速率[14]。

回肠是肠道病原体感染及炎症多发部位，一些病原体主要通过回肠FAE中的M细胞感染人和动物的肠道[15-17]。薄清如等认为，PEDV主要侵袭、感染仔猪小肠绒毛上皮细胞，以回肠中后部病毒含量最高[18]。本研究首先通过病原学检测确定试验仔猪为PEDV感染，采用免疫组化证实了PEDV在仔猪回肠某些绒毛上皮细胞的顶膜、细胞质、细胞核及其上皮下层的分布，采用透射电镜进一步验证了这些被病毒感染的绒毛上皮细胞为M细胞。另外，研究过程中作者也仅在回肠绒毛M细胞中观察到PEDV粒子的存在，而在十二指肠和空肠绒毛M细胞中均没有观察到病毒颗粒(数据没有显示)，以上结果暗示了仔猪回肠绒毛M细胞可能是PEDV感染的重要通道。由于实验条件的限制，本研究仅对自然感染条件下的PEDV与回肠绒毛M细胞之间的关系进行了初步探索，下一步将在分离病毒的基础上构建PEDV人工感染模型，从而对PEDV与肠道M细胞之间的关系开展更加深入的研究。

本研究首次对新生仔猪回肠绒毛M细胞的形态及分布特征进行了报道，并初步探索自然感染情况下PEDV与回肠绒毛M细胞的关系。这为进一步研究PEDV的致病机制和M细胞的免疫学功能奠定了基础。

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(编辑白永平)

Morphological and Distribution Characteristics of Villous M Cells in the Ileum of Newborn Piglets and the Association with PEDV Infection

LI Ren-feng1，2，4，TIAN Xiang-qin5，QIAO Song-lin2*，GUO Jun-qing2，ZHOU En-min4，ZHANG Gai-ping3*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang453003，China；2.KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture，KeyLaboratoryofAnimalImmunology，HenanAcademyofAgriculturalSciences，Zhengzhou450002，China；3.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China; 4.CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；5.KeyOpenLaboratoryforTissueRegenerationofHenanUniversities，XinxiangMedicalUniversity，Xinxiang453003，China)

Abstract:The aim of this study was to identify the presence of villous M cells in the ileum of newborn piglets and determine the distribution pattern，morphological characteristics and the association with PEDV infection by immunofluorescence assay(IFA)，immunohistochemistry(IHC) and morphological methods.IFA showed a gradually decreased density of villous M cells from lower crypt epithelium to upper villous epithelium.The villous M cells showed typical morphological characteristics of M cells by electron microscope.After infected with PEDV，villous M cells in the ileum exhibited pathological changes obviously.The virus particles of PEDV were observed on the apical membrane，in the cytoplasm，around the nucleus and subepithelial of villous M cells by immunohistochemical staining of PEDV S protein，which were not observed in its adjacent epithelial cells.This study demonstrated the presence of villous M cells in the ileum of newborn piglets and determine the distribution pattern，morphological characteristics and the association with PEDV infection，suggesting the villous M cells in the ileum may be an important entry for PEDV invasion.

Key words:intestinal villous M cells；newborn piglets；porcine epidemic diarrhea virus

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.022

收稿日期：2015-08-17

基金项目：国家生猪产业技术体系(CARS-36)；河南省生猪产业技术体系创新团队(S2012-06)

作者简介：李任峰(1978-)，男，河南驻马店人，博士生，主要从事动物病原学与免疫学研究，E-mail：lirenfeng@sina.com *通信作者：张改平，研究员，E-mail：zhanggaiping2003@163.com；乔松林，研究员，E-mail：cdj565@gmail.com

中图分类号：S852.16；S852.659.6

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)03-0581-06