猪病毒性腹泻检测基因芯片的两种样品标记技术比较

马　锐，尹人杰，黄小波，文心田，杨国淋，常晓霞，张　仙，滑　翔，赵玉佳，曹三杰，文翼平，伍　锐

(1.四川农业大学动物医学院，猪病研究中心与基因芯片实验室，成都 611130；2.四川省崇州市农村发展局，崇州 611200)



猪病毒性腹泻检测基因芯片的两种样品标记技术比较

马锐1#，尹人杰1，2#，黄小波1*，文心田1，杨国淋1，常晓霞1，张仙1，滑翔1，赵玉佳1，曹三杰1，文翼平1，伍锐1

(1.四川农业大学动物医学院，猪病研究中心与基因芯片实验室，成都 611130；2.四川省崇州市农村发展局，崇州 611200)

摘要：对猪病毒性腹泻检测芯片的两种样品标记方法进行比较。分别选取猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S和M基因，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的N和S基因，A型猪轮状病毒(GAR)的VP7和NSP4基因设计引物，用PCR扩增制备靶基因，纯化后制备猪病毒性腹泻联合检测基因芯片。提取样品核酸，采用Cy3直接标记法和间接标记法进行PCR扩增标记，标记的样品再与芯片杂交、扫描和数据分析，同时对两种标记方法的特异性、敏感性等进行了比较。结果表明，两种方法标记的样品均能与基因芯片特异性杂交，但直接法的中位信号值(median)均高于间接法的中位信号值，直接法的芯片杂交信噪比是用间接法的5倍以上。两种标记方法制备样品特异性好，猪蓝耳病毒、猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒验证检测为阴性；直接法和间接法的最低检测浓度分别为105和107copies·μL-1，前者的灵敏性是后者的100倍。应用优化的直接标记法处理56份临床样品，进行芯片的检测应用，结果与RT-PCR一致。本研究结果表明直接法荧光标记样品可明显提高病毒性腹泻检测芯片的检测效果。

关键词：猪腹泻病毒；基因芯片；直接标记；间接标记；比较

猪流行性腹泻病(porcine epidemic diarrhea，PED)、猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis of swine，TGE) 和A型猪轮状病毒病(group A porcine rotavirus，GAR) 是分别由猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)以及A型猪轮状病毒(GAR)引起的一类高度接触性肠道传染病[1-2]。这三种病的临床症状主要表现为严重腹泻、呕吐和脱水，给我国养猪业造成了巨大损失[3]。自1971年在英国发现PEDV以来，到20世纪90年代已蔓延至整个欧洲，对欧洲养猪业造成了严重后果[4-5]。随后PEDV传播至日本[6]、韩国[7-8]、泰国[9]、中国[10]等亚洲国家，并引起腹泻疾病的暴发以及猪传染性胃肠炎和轮状病毒病混合感染[11]。2013年后该病在美国、加拿大等国家暴发猪流行性腹泻病，造成极大经济损失[12-13]。仔猪病毒性腹泻检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)[14]、环介导等温扩增技术(LAMP)[15]、间接荧光抗体试验(IFA)[16]、病毒中和试验(VNT)[17]、RT-PCR[18]等，但这些技术无法同时高通量排查多种疾病。基因芯片技术具有高特异性、高灵敏性、高通量、快速检测等优点，被广泛应用于基因位点突变分析、基因表达谱分析、疫病诊断和药物筛选等领域[19-20]。与传统检测技术相比，基因芯片诊断技术可以更快、更准确地同时检测大量样本[21]。

基因芯片技术的检测结果影响因素很多，其中样品的处理与标记技术是影响检测结果的重要因素之一。本研究在前期成功构建检测基因芯片的基础上，结合猪病毒性腹泻疫病最新流行态势和芯片技术的研究进展，进行了芯片样品标记技术的创新和改进[22]。利用荧光直接标记法(Cy3直接标记在引物上)与荧光间接标记法(Cy3-dCTP)分别对靶基因进行扩增标记，再与构建的PEDV-TGEV-GAR的联合检测基因芯片进行杂交，比较两种方法的杂交效率，为筛选出最佳的样品标记技术和提升基因芯片临床检测效果奠定基础。

1材料与方法

1.1质粒

基因重组质粒PEDV-S、PEDV-M、TGEV-S、TGEV-N、GAR-VP7、GAR-NSP4均由四川农业大学猪病研究中心室构建保存，对照实验阳性质粒(PRRSV+CSFV+JEV+PCV2)由四川农业大学猪病研究中心室保存，λ定位基因购自宝生物(大连)生物科技有限公司。

1.2仪器及试剂

基因芯片点样仪、基因芯片扫描仪均购自北京博奥生物公司；氨基载玻片、点样缓冲液购自上海百傲生物公司；质粒提取试剂盒购于美国Omega生物技术公司；2×TaqPCR Master Mix、反转录试剂盒、总RNA提取试剂盒和DNA提取试剂盒购自天根生物公司；Cy3-dCTP购自英国Amersham Biosciences公司。

1.3引物设计

定位基因引物参考曹三杰等[23]设计合成。检测基因引物使用DNAMAN软件对GenBank中收录的PEDV、TGEV、GAR、PRRSV、CSFV、JEV以及PCV2基因序列比对分析，用Primer 5.0软件根据PEDV的S和M基因、TGEV的S和N基因、GAR的VP7和NSP4基因、PRRSV的NSP2基因、CSFV的Ern基因、JEV的PrM/M基因以及PCV2的ORF2基因的保守区设计出长度在200～500 bp、Tm值在55 ℃±2 ℃间的10对引物。每对引物包括一条上游引物及两条下游引物，并将其中一条下游引物的5′端进行Cy3修饰用于靶基因的标记(表1)。引物均由上海宝生物公司合成。

表1引物信息及基因片段长度

Table 1Information of primers for probe and length of fragment

病毒Viruses目标基因Targetgenes长度/bpLength引物序列(5'-3')SequencesofprimersTGEVN362F:TTCCTGAAAGGTGGTTCTTCTACTA;R:TTTTCTGTGTCAACACCTAACTTT;L:Cy3-TTTTCTGTGTCAACACCTAACTTTS274F:AGGCTTGACGAATTGAGTGCTGATG;R:AGTTTCATAAGCCGTTGGTAATAGC;L:Cy3-AGTTTCATAAGCCGTTGGTAATAGCPEDVS474F:CGCTAGGCTTGAGTCTGTTG;R:AATTGCTGGTTCCGCTGTAG;L:Cy3-AATTGCTGGTTCCGCTGTAGM421F:CTTATGGCTTGCATCACT;R:GCACTTTCTCGCTATCTG;L:Cy3-GCACTTTCTCGCTATCTGGARVP7381F:TTGAATGAATGGCTATGTAATCC;R:ACGCATCATTCTTTCAGTTTGT;L:Cy3-ACGCATCATTCTTTCAGTTTGTNSP4270F:GAACAGGTTACTACTAAGGATG;R:TCACATAGACGCAGTTACTTCC;L:Cy3-TCACATAGACGCAGTTACTTCCPositivegeneλ500F:AAAGCGACGCAATGAGGCACT;R:GTTCCACGACCGCAACTGC;L:Cy3-GTTCCACGACCGCAACTGCPRRSVNSP2400F:GGTTCGGAAGAAACTGTCGG;R:GAGCTGAGTATTTTGGGCGTG;L:Cy3-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTGCSFVErn248F:TCAATGGAACCTGAGTGACAAC;R:TATTGTGCCAGTTACACCATCC;L:Cy3-TATTGTGCCAGTTACACCATCCJEVPrM/M451F:CATCAACAACACGGACATTGC;R:AGCGACCAACAGCAGGAG;L:Cy3-AGCGACCAACAGCAGGAGPCV2ORF2494F:CACGGATATTGTAGTCCTGGTCG;R:CCGCACCTTCGGATATACTGTC;L:Cy3-CCGCACCTTCGGATATACTGTC

F.上游引物；R.下游引物；L.标记下游引物

F.Forward primer；R.Reverse primer；L.Labeled primer

1.4探针的制备

复苏含6种基因的重组质粒菌，以试剂盒提取重组质粒，稀释50倍后作为PCR反应模板。PCR反应体系为50 μL：10×PCR Buffer(Mg2+free)5.0 μL、MgCl2(25 mmol·L-1) 4.0 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1) 4.0 μL、特异性的引物对 2.0 μL、质粒及定位基因 4.0 μL、TaqDNA聚合酶 0.5 μL混匀，去离子水补足50.0 μL进行PCR反应。反应程序：94 ℃2 min；94 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，共34个循环；72 ℃延伸10 min。取6 μL PCR产物用2%的琼脂糖凝胶验证。用乙醇沉淀法对PCR产物进行纯化后，作为探针保存在-20 ℃。

1.5芯片的设计与构建

将纯化好的探针与点样缓冲液按1∶1稀释后加入点样孔板中，设置阴性对照为点样缓冲液。按照设计的检测阵列的排布和性能参数，进行接触式点样(图1)。点样结束后置于紫外线下交联30 min，再于80 ℃烘烤2 h，密封于4 ℃备用。

图1　基因芯片矩阵设计Fig.1　The design of DNA microarray spotting

1.6两种荧光标记方法标记靶基因

为确定最佳标记方式，本研究对比使用Cy3直接引物标记法和间接C碱基标记法，最后将得到的靶基因进行芯片杂交，通过扫描分析数据，确定靶基因标记方式。

1.6.1直接引物标记以PEDV-M、PEDV-S、TGEV-N、TGEV-S、GAR-NSP4、GAR-VP7阳性质粒为模板进行PCR扩增。50 μL反应体系如下：10×PCR Buffer(Free Mg2+) 5.0 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)4.0 μL，dNTP Mixture(10.0 mmol·L-1)4.0 μL，5′端标记有Cy3的反向引物1.0 μL，非荧光正向引物1.0 μL，模板2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)1.0 μl，去离子水32.0 μL。反应程序：94 ℃2 min；95 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，共34个循环；72 ℃延伸10 min；12 ℃保存。反应完毕，各取6 μL靶基因产物以2.0%的琼脂糖凝胶电泳分析。1.6.2间接C碱基标记同样以6种阳性质粒为模板进行PCR扩增。50 μL反应体系如下： 10×PCR Buffer(Free Mg2+) 5.0 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)4.0 μL，dNTP Mixture(10.0 mmol·L-1)4.0 μL，不含荧光的上下游引物对2.0 μL，模板2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)1.0 μL，去离子水31.5 μL，并在反应体系中加入终浓度为0.25 mmol·L-1的CY3-dCTP 0.5 μL。扩增体系条件与“1.6.1”相同。反应完毕，各取6 μL靶基因进行电泳分析。

1.7芯片杂交与结果判定

分别将直接标记法和间接标记法标记好的靶基因与杂交缓冲液以1∶1的比例混合，于95 ℃变性3 min，放冰上冷却。在每个阵列上滴加50 μL靶基因产物混合液，用围栏固定后放入杂交盒。在48 ℃与芯片杂交3 h，取出芯片，按洗液1(2×SSC+0.1%SDS)、洗液2(0.5×SSC+0.05%SDS)、洗液3(0.2×SSC)、洗液4(双蒸水)的顺序依次洗涤5 min。离心干燥后进行扫描分析。

扫描仪开通绿色532 nm荧光单通道，以9个点信号中位值(median)以及其与背景信号平均值的比值(SNRm)为判定依据。当median≥1 000、SNRm值≥2，阳性对照和阴性对照均成立；扫描出的各个点阳性清晰可见，四者结果一致可以判定为杂交结果成立。

1.8两种标记法的芯片特异性比较

提取PEDV、TGEV、GAR、PRRSV、CSFV、JEV以及PCV2基因的阳性质粒为模板，分别用直接标记法和间接标记法进行PCR扩增，将PCR产物与制备好的芯片杂交，扫描并分析结果，以验证基因芯片的特异性。

1.9两种标记法的芯片灵敏性比较

测定各质粒常规PCR胶回收产物的OD260 nm，换算成DNA的拷贝数，其浓度分别为PEDV-M(1.29×1011copies·μL-1)、PEDV-S(1.15×1011copies·μL-1)、TGEV-N(1.26×1011copies·μL-1)、TGEV-S(1.22×1011copies·μL-1)、GAR-NSP4(1.39×1011copies·μL-1)以及GAR-VP7(1.46×1011copies·μL-1)。作101～109倍比稀释后，分别用直接标记法和间接标记法进行荧光标记，与制备的共检芯片杂交，以评价该共检芯片的灵敏性。

1.10直接标记法芯片的重复性试验

同批次芯片的重复性：选取PM(1.29×1010copies·μL-1)和PS(1.15×109copies·μL-1)靶基因用不对称RT-PCR直接标记产物，取同批次基因芯片5张分别与其杂交。评价该共检芯片的稳定性。

单张芯片的重复性：取一张制备好的芯片进行杂交，扫描分析后，将该芯片变性消除杂交斑点，立即将该芯片再次进行下一次杂交，继续扫描分析，如此重复8次。从而获得一张芯片的最高检测上限。

1.11荧光直接标记法的临床应用评价

收集来自四川省绵阳、阿坝茂县、彭州、资阳安岳、眉山、广安、攀枝花、巴中通江地区的56份送检小肠病料，所有小肠病料均来自有腹泻症状且30 d以下的仔猪。小肠病料经研磨后，转入超净台。严格按照总RNA提取试剂盒说明书步骤提取RNA后，以RNA为模板，使用反转录试剂盒进行反转录。反转录步骤严格按照反转录试剂盒说明书进行，反转录总体系为10 μL，反应体系如下： 5×Prime Script Buffer 2.0 μL，Prime Script RT Enzyme Mix (25 mmol·L-1)0.5 μL，Random 6 mers(10.0 mmol·L-1)0.5 μL，模板RNA 2.0 μL，RNAse Free ddH2O 5 μL。反转录反应程序：37 ℃15 min；85 ℃5 s；4 ℃保存cDNA。通过直接标记法进行靶基因扩增，与共检芯片杂交，扫描分析数据。

2结果

2.1引物特异性验证

将“1.4”中未纯化的PCR产物电泳鉴定。结果可见三种病毒的扩增目的基因片段与预期大小一致：PEDV-M:421 bp、PEDV-S:474 bp、TGEV-N:362 bp、TGEV-S:276 bp、GAR-NSP4:270 bp、GAR-VP7:381 bp(图2)，可见引物特异性好。

2.2靶基因标记方法比较

基因杂交结果表明，使用Cy3引物直接标记法获得的扫描参数，通过肉眼直观判断，可见其优于Cy3-dCTP间接标记方法(图3)。两种不同的标记方法并没有影响芯片杂交的背景值，但使用Cy3引物直接标记法获得的中位值比使用Cy3-dCTP间接

标记方法高7 000以上；比较SNR值，前者是后者的5倍以上，因此选用5′端标记有Cy3的反向引物作为靶基因的标记方式可提高芯片杂交效率(表2)。

M.100 bp ladder DNA 相对分子质量标准；1.PEDV-M；2.PEDV-S；3.TGEV-N；4.TGEV-S；5.GAR-NSP4；6.GAR-VP7；7.阴性对照M.100 bp ladder DNA marker；1.PEDV-M；2.PEDV-S；3.TGEV-N；4.TGEV-S；5.GAR-NSP4；6.GAR-VP7；7.Negative control图2　目的基因的PCR扩增Fig.2　The PCR amplification results of target gene

图3　不同标记方法的杂交结果Fig.3　Scan results of different labeling method

2.3两种标记法的特异性

试验结果表明：分别用直接标记法与间接标记法标记的芯片，对GAR、TGEV、PEDV单独检测时在阵列设置的相应位置都出现了肉眼可见杂交斑点，且无明显的非特异性杂交情况出现。对PRRSV+CSFV+JEV+PCV2阳性质粒检测结果均为阴性。两者结合表明两种标记方法应用于共检芯片都具有高特异性(图4)。

2.4两种标记法芯片的灵敏性

结果表明(图5)：用直接标记法，PEDV-M探针、PEDV-S探针、TGEV-N探针、TGEV-S、GAR-NSP4以及GAR-VP7探针检测的最低浓度分别为1.29×105、1.15×105、1.26×105、1.22×105、1.39×105以及1.46×105copies·μL-1。综上所述，使用直接标记法，该检测芯片的最低检测浓度为105copies·μL-1。同理，使用间接标记 Indirect-labeling法与稀释的探针杂交，6种探针的最低浓度分别为1.29×107、1.15×107、1.26×107、1.22×107、1.39×107、1.46×107copies·μL-1。使用间接标记法与探针杂交，最低检测浓度为107copies·μL-1。

表2不同标记方法的杂交信号

Table 2Signal intensity of different labeling method by asymmetric PCR

检测基因Genesdetected标记方式Labelingmethods中位值Median背景值BackgroundSNRmPEDV-M间接标记Indirect-labeling16033214.99直接标记Direct-labeling960533628.59PEDV-S间接标记Indirect-labeling16603325.00直接标记Direct-labeling936131629.62TGEV-N间接标记Indirect-labeling16433334.93直接标记Direct-labeling978731231.37TGEV-S间接标记Indirect-labeling15323424.48直接标记Direct-labeling934032628.65NSP4间接标记Indirect-labeling16063195.03直接标记Direct-labeling944532728.89VP7间接标记Indirect-labeling15903155.05直接标记Direct-labeling968933129.27

2.5直接标记法芯片的重复性试验

同批次芯片的重复性：选取PM(1.29×1010copies·μL-1)和PS(1.15×109copies·μL-1)靶基因用不对称RT-PCR直接标记，与同批次基因芯片5张杂交。其中PM探针杂交信号中位值为8 801.80±492.58，变异系数为5.58%，SNR值为22.12±1.21，变异系数为5.47%。PS探针杂交信号中位值为8 949.60±584.13，变异系数为6.52%，SNR值为22.09±1.57，变异系数为7.10%。结果表明杂交信号稳定性良好(图6)。

单张芯片的重复性：单张芯片最多可重复利用7次，在第八次时SNRm值均小于2.0(图7)。

2.6直接标记法的临床应用

共检芯片检测结果表明(表3)三种病毒在西南地区猪群中普遍以PEDV单独感染为主。混合感染仅有PEDV+GAR 2例，TGEV的单纯感染有4例。与PCR检测对比，符合率为100%，利用直接标记法可以有效提高芯片的检测质量。

3讨论

基因芯片技术自M.Schena等[24]1995年首次报道以来，因其具有高通量平行检测多个病原体基因、高准确度和高灵敏性等特点受到广泛关注。作为一种新型的检测方法，已被用于识别和诊断病原体，环境微生物和临床样本等[25]。然而影响基因芯片杂交效果的因素很多，其中样品的标记技术是重要因素之一。本研究分别将直接标记法和间接标记法应用于基因芯片杂交检测，对两种荧光标记方法进行了对比。结果表明直接标记法可显著提高芯片杂交效率。

靶基因标记的常用方法为间接标记法和直接标记法两种。一种为扩增时掺入荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸(间接标记)；另一种为引物的5′端加入荧光修饰基团后进行扩增(直接标记)。直接标记靶基因的优点在于其可在引物结合阶段进行标记，过程省时省力且无需更多优化[26-27]。而间接标记法不但需要消耗大量时间来制作链接标记物，还需要对所掺入的荧光标记物进行浓度、温度等优化[28-29]。目前常用于生物芯片的标记物主要包括：放射性同位素标记、生物素标记和荧光染料标记。由于放射性同位素对实验人员的危害过于严重，现在基本淘汰使用。生物素可同时标记在玻片载体和膜载体上，因其不需要避光等优点，常被用于可视化芯片检测[30-31]。荧光标记主要适用于玻片载体上，可有效提高SNR值。常用的荧光标记物分为Cy3和Cy5，两种标记物可单一使用，也可使用双通道扫描[32]。因为Cy3在结构上比Cy5少两个次甲基组，所以在标记反应中消耗更少的能量。其次Cy5对空气中的O3比较敏感，使得暴露在空气中的Cy5易被其破坏，造成实验误差[33]。

图4　特异性试验杂交结果Fig.4　The hybridization result of specific experiment

A～C.使用直接标记法与芯片杂交；D～F.使用间接标记法与芯片杂交A-C.Direct-labeling method;D-F.Indirect-labeling method图5　灵敏性试验杂交结果Fig.5　The hybridization result of sensitivity experiment

图6　不同批次芯片重复利用荧光信号扫描结果Fig.6　Scan result of fluorescence intensity of different batch microarray repeatedly used

图7　单张芯片重复利用荧光信号扫描结果Fig.7　Scan result of fluorescence intensity of single microarray repeatedly used

表356份样品的检测结果

Table 3The detection result of 56 samples

感染类型InfectiontypeRT-PCR(X)共检芯片(Y)Microarray(Y)X与Y的符合率/%TheaccuracyofXandY芯片检测感染率/%MicroarraydetectionratePEDV38/5638/5610067.8TGEV4/564/561007.1PEDV+GAR2/562/561003.6PEDV、TGEV、PEDV+GAR44/5644/5610078.6

本试验采用Cy3作为标记的荧光素，分别使用直接标记法与间接标记法对靶基因进行标记。特异性试验和灵敏性试验结果表示，两种标记方法都有良好特异性，然而直接标记法灵敏性较间接标记法高100倍。分析原因认为，Cy3-dCTP间接标记中的C键本身对C碱基具有很强的位阻作用，使得靶基因在PCR扩增反应效率降低，不利于靶基因产物量的增加和Cy3对靶基因的标记；同时，间接标记在PCR反应中的掺入浓度需要反复摸索条件，且在PCR反应中需要单独掺入一定量dCTP引导Cy3-dCTP扩增标记，增加了生产成本；其次间接标记本身只标记的是靶基因产物中的C碱基，因此对于引物设计时扩增产物中C碱基占有的比重与杂交效率也有一定影响，靶基因产物中C碱基的含量决定了Cy3标记上的量的多少。基于这两点使得间接标记的靶基因杂交后信号值大大低于Cy3直接引物标记。而在引物5′端引入Cy3标记能消除上述两种不利影响，且在试验成本上两种方法大体一致，因此本试验采用Cy3引物直接标记法大大增强了芯片杂交效率。

本研究利用已知阳性质粒对基因芯片的制备进行了特异性、灵敏性及重复性评价试验。试验结果显示，该芯片对TGEV、PEDV、GAR有高特异性，且不与PRRSV、CSFV、JEV、PCV2发生反应。5个不同批次制备的芯片与阳性质粒进行杂交，信号结果差异性小，检测结果再现度高；同一张芯片可重复检测7次，稳定性好。应用该芯片进行56份临床样本检测，与RT-PCR结果一致，再次证明该芯片特异性高，稳定性好。

本研究在比较了两种标记方法的基础上，进一步应用直接标记法进行了临床样品的验证，检测其实用性。检测结果显示(表3)：RT-PCR检测结果显示56份样品中RT-PCR与共检芯片显示阳性感染率同为78.6%，两者符合率为100%。与健康猪相比，病毒性腹泻病的感染率为78.6%，与Q.Zhang等文章[34]中所列出的中国猪腹泻病感染率相一致，低于R.Q.Sun等报道[35]中所说的82%。56份临床检测样品，其中67.8%为PEDV单独感染，与Q.Zhang等[34]所报道的PEDV感染率相同，高于捷克斯诺伐克(18.8%)和韩国(50.4%)[36-37]。结果表明，应用直接标记法可有效提高芯片杂交效率。

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(编辑白永平)

Comparision of Two Fluorescence-labeling Methods of Porcine Diarrheal Viruses Detection Microarrays

MA Rui1#，YIN Ren-jie1，2#，HUANG Xiao-bo1*，WEN Xin-tian1，YANG Guo-lin1，CHANG Xiao-xia1，ZHANG Xian1，HUA Xiang1，ZHAO Yu-jia1，CAO San-jie1，WEN Yi-ping1，WU Rui1

(1.PorcineDiseaseResearchCenterandMicroarrayLaboratory，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China；2.InstituteofRuralDevelopmenofChongzhou，Chongzhou611200,China)

Abstract:Two samples labeling methods of microarray detection for diarrheal viruses are compared respectively in this study.Primers were designed based on the sequences ofSandMgene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV)，SandNgene of Transmissible Gastroenteritis Virus(TGEV)，VP7 andNSP4 gene of Group A Porcine Rotavirus(GAR)，and then were used to amplify the target genes by PCR.The target genes were purified using ethanol precipitation to manufacture simultaneous detection microarray.Fluorescence molecules were imported to PCR products by direct-labeling method and indirect-labeling method respectively after extraction of virus RNA from samples.The specificity and sensitivity of two labeling methods were compared by scanning and analyzing the results after PCR products hybridized with microarray.The results showed that microarray based on two different labeling methods could both hybridize with target genes with high specificity.However，the median signal volumes of direct-labeling were higher than those of indirect-labeling and Signal to Noise Ratio(SNR) of direct-labeling was more than five times higher compared with that of indirect-labeling.Specific test results showed that two labeling methods were both specific and CSFV，PRRSV，PCV-2，JEV detection showed negative result.Sensitivity test results suggested that the sensitivity of direct-labeling were 100 times higher than that of indirect-labeling.The minimum concentration of direct-labeling method and indirect-labeling method can be detected reliably were 105copies·μL-1and 107copies·μL-1，respectively.A total of 56 clinical samples were treated with direct-labeling and hybridized with the microarray，the results were consistent with those of RT-PCR.This study indicate that direct-labeling technology could effectively improve the detection effect of diarrhea microarray.

Key words:porcine diarrhea virus；microarray；direct-labeling；indirect-labeling；comparison

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.015

收稿日期：2015-08-10

基金项目：公益性行业(农业)科研专项项目(201203056)

作者简介：马锐(1989-)，男，四川成都人，硕士生，主要从事动物传染病研究，E-mail：iwanttogetsci@163.com；尹人杰(1989-)，为本文共同第一作者 *通信作者：黄小波，教授，E-mail：rsghb110@126.com

中图分类号：S854.43

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)04-0752-10