组织培养技术筛选植物耐盐突变体的研究进展

钟琪

摘要 在介绍耐盐突变体筛选技术的基础上，综述了利用组织培养技术筛选植物耐盐突变体的国内外研究现状，指出了存在的问题，并对其应用前景进行了展望。

关键词 土壤盐渍化；组织培养；耐盐突变体

中图分类号 Q813.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）05-145-04

Abstract On the basis of introducing screening technology of salt tolerant mutant， research status about screening of plant salt tolerant mutant with tissue culture technology at home and abroad was reviewed， existing problems were pointed out， the future prospect was forecasted.

Key words Soil salinization； Tissue culture； Salt tolerant mutant

据联合国教科文组织 （UNESCO）和世界粮农组织（FAO）不完全统计，全世界盐渍土面积约 10亿hm2[1]，有100多个国家不同程度地遭受其害[2]。我国盐渍土面积约3.6×107hm2[3]，土壤盐渍化严重制约农林业生产的发展，破坏了土地资源环境，进一步导致生态环境的恶化，影响了人们正常的生产生活。盐碱地改良利用可增加粮食产量，改善生态环境，促进经济和社会的可持续发展。因此，开发利用盐碱地成为当务之急。

开发利用盐碱地主要有工程措施和培育耐盐碱植物品种2种途径。工程治理需耗费大量人力、物力、财力，加上淡水资源的贫乏，受到了很大限制。而培育耐盐碱植物品种投资少、见效快，在我国当前经济条件下成为行之有效的手段而被人们所接受。

虽然通过常规育种途径选育出一些耐盐植物品种，但大多缺乏抗盐种质资源，而非盐碱条件下的选育使其耐盐性遗传变异非常有限，且易丢失。另外，常规育种周期相对较长，难以培育出理想的耐盐品种。20世纪70年代发展起来的植物组织和细胞培养技术为选育抗盐植物提供了新的手段。植物组织和细胞培养过程中会发生高频率的广泛变异[4]，通过诱变处理能大幅度提高变异的频率和范围。另外，因其具有操作方便、可控性强、周期短、成本少等优点而受到国内外学者的重视。笔者在介绍耐盐突变体筛选技术的基础上，综述了利用组织培养技术筛选植物耐盐突变体的国内外研究现状，指出了存在的问题，并对其应用前景进行了展望。

1 耐盐突变体的筛选技术

1.1 建立能够长期保持高频率分化能力的无性系

同一植物不同基因型、不同年龄、不同部位以及不同生理状态的外植体，培养基种类、激素成分与浓度均影响分化频率，随着继代培养次数增加分化频率逐渐降低。耐盐突变体筛选需要长期反复继代培养，因此，能否建立长期保持高频率再生分化能力的无性系也是该项工作能否成功的重要基础。随着组织培养技术的不断完善和提高，对不同植物，选取不同发育时期的外植体，不同种类的培养基和激素，采用不同的培养方法，诱导出分化频率较高的愈伤组织，经过多次继代培养仍具有分化能力。

1.2 筛选耐盐愈伤组织变异系的方法

建立愈伤组织无性系后，一般采用典型的直接选择法筛选耐盐愈伤组织变异系。选择程序分为一步选择和多步选择。2种选择程序的步骤一般为：从抑制培养基中分离出假定的突变体，通过有盐无盐连续几代培养，清除可能逃脱选择剂抑制而漏网的野生型细胞和对选择剂上瘾的野生型细胞，从而获得稳定的耐盐细胞系。

1.2.1 一步选择。王仑山等[5]将诱变处理后存活的枸杞下胚轴诱导的愈伤组织转入含1.5%NaCl的诱导培养基上培养28 d，再将存活的愈伤组织转入含1.0%NaCl的相同培养基上培养，每21 d转移一次，共继代14次，最终获得耐1.0%NaCl愈伤组织的变异体。李娟等[6]以4个马铃薯栽培品种的叶片为外植体采用一步直接筛选法获得了耐不同浓度NaCl的愈伤组织。戴伟民等[7]以番茄下胚轴为外植体诱导的愈伤组织，将其培养在10 g/L NaCl的选择培养基上，经过3次继代筛选得到耐盐愈伤组织。

1.2.2 多步选择。王存喜等[8]以中华猕猴桃101品系试管苗叶片为外植体，将诱导出的愈伤组织转入含NaCl的MS培养基选择8次，培养基中NaCl浓度逐步增加，γ射线做诱变剂，筛选出耐0.5%、0.7%、1.0%NaCl的变异细胞系。周荣仁等[9]将栽培烟草叶片诱导的愈伤组织采用逐步提高0.5%NaCl的方法，挑选生长良好的愈伤组织继代培养，获得了耐0.5%、1.0%、1.5%、2.0%NaCl的细胞系。张亚兰等[10]以短芒大麦幼穗、幼胚和成熟胚为外植体，建立了胚性悬浮细胞系，以此为材料，结合诱变剂EMS处理，获得了耐不同浓度NaCl愈伤组织变异体。薛建平等[11]将药菊叶片诱导出的愈伤组织用0.2%和0.5%EMS分别经浸渍法和滴加法处理，将恢复增殖14 d后存活的愈伤组织逐级转移至0.5%、1.0%、1.5%NaCl的培养基，每级浓度培养14 d，获得了耐盐愈伤组织变异体。毛桂莲等[12]对枸杞叶片诱导的愈伤组织用不同剂量60Coγ射线处理，将恢复增殖后的愈伤组织，采用逐步提高NaCl浓度的方法，分别接种于含0、0.25%、0.50%、1.00%、1.25%、1.50%NaCl的选择培养基上，将生长较快的愈伤组织逐级提高NaCl浓度，每21 d转移一次，最终筛选出耐1.00%NaCl的愈伤组织变异体。还有在红豆草[13]、玉米[14]、木槿[15]、水稻[16]、沙打旺[17]、紫花苜蓿[18]、小麦[19]等植物中获得成功的报道。

另外，也有学者对小麦[20]、番茄[21]、大蒜[22]、结缕草[23]采用2种程序同时进行耐盐愈伤组织变异系筛选的报道。

在筛选耐盐愈伤组织变异体之前，有学者进行了理化诱变处理，增大了选择机会，提高了变异频率，但也有提高变异频率不明显的报道[15]。物理诱变剂包括60Co γ射线、X射线、快中子、电子束、激光、微波等，多用于照射种子或外植体。其中离子辐射的诱变频率高于γ射线，并能诱导多个性状同时发生变异，具有广阔的前景。化学诱变剂主要有EMS、抗菌素（平阳霉素、正定霉素）、NaN3等，多用于处理愈伤组织。单纯用物理诱变或化学诱变，诱变效果不太理想，诱变范围较窄，而2种方法结合使用，诱变效果较为理想。诱变剂的使用剂量一般应低于半致死剂量，减少其产生的不良后果，诱变处理后的材料需恢复培养后再进行筛选。因诱变处理可能导致原有的优良性状消失，产生不良的变异，所以在筛选耐盐突变体时，应对材料部分进行诱变处理，部分不加处理，最终确定是否需要诱变处理。

1.3 耐盐愈伤组织变异系的耐盐性及其耐盐稳定性的分析

筛选所得的耐盐愈伤组织变异系是否为变异体必须进行耐盐性及耐盐稳定性分析。耐盐性分析是把对照和在无盐的诱导培养基上培养多代的耐盐愈伤组织分别转入含不同浓度盐分的继代培养基上培养一段时间（对照愈伤组织基本停止生长时），以鲜（干）重的相对生长量（相对生长量=[培养一定时间后的鲜（干）重—原鲜（干）重]/原鲜（干）重）表示耐盐性。在较高选择压下，相对生长量较高的愈伤组织可认为是具有耐盐性的愈伤组织。而耐盐稳定性分析是把对照和在无盐诱导培养基上培养多代的耐盐愈伤组织转入一定含盐量的诱导培养基上培养一段时间（对照愈伤组织基本停止生长时），以鲜（干）重的相对生长量（相对生长量=[培养一定时间后的鲜（干）重-原鲜（干）重]/原鲜（干）重）表示，每7 d计算一次相对生长量，相对生长量随培养时间增加而增加的愈伤组织可认为是耐盐性稳定的愈伤组织。

王仑山等[5]将对照和在无NaCl的诱导培养基上培养4代的枸杞耐盐愈伤组织分别转入含0.25%～1.50%NaCl的诱导培养基培养，21 d后以鲜重的相对生长量[相对生长量=（培养21 d后鲜重-原鲜重）/原鲜重]表示耐盐性。在不同NaCl浓度下，耐盐变异体相对生长量均高于对照，说明耐盐变异体具有耐盐性。将对照和在无NaCl的诱导培养基上培养4代的枸杞耐盐愈伤组织转入含1.0%NaCl的诱导培养基培养，21 d后相对生长量持续增加，说明其耐盐性稳定。还有对大麦[10]、小麦[24]、菊花[11]进行耐盐性及耐盐稳定性分析的研究。

1.4 耐盐愈伤组织的分化及其再生植株的耐盐性鉴定

由于耐盐愈伤组织变异系分化再生植株较难，所以，应建立能长期保持再生分化能力的愈伤组织无性系，另外，还应尽早对耐盐愈伤组织进行分化培养，一般继代培养2次即可转入无盐或加盐的分化培养基培养，将分化苗壮苗、移栽，以便在植株水平上进一步筛选鉴定。再生植株的耐盐性鉴定多用正常条件下愈伤组织分化的植株做对照，将耐盐再生植株在无盐条件下培养一段时间后，再转至一定浓度盐压下生长，分别计算植株各个性状的耐盐系数和耐盐指数，确定耐盐级别。还可以测定植株叶片中K+、Na+等离子含量，游离脯氨酸含量，可溶性糖含量，相对电导率等生理生化指标。经过鉴定为耐盐植株的，将获得的种子加以繁殖，或取后代植株的叶片、茎段等作为外植体，对其进行盐胁迫处理，有性繁殖后代具有耐盐性的，可认为是耐盐突变体。

2 国内外研究现状

2.1 再生植株的耐盐性能通过有性繁殖遗传给后代

Nabors等[25]通过9次增加NaCl浓度的多次选择法，于1975年获得了第一个烟草耐盐细胞系，并分化出耐盐植株，其连续自交两代后能稳定地耐受海水的灌溉，这也是首例通过有性繁殖将耐盐性遗传给后代的报道。Zenk[26]用组织培养技术首次成功地筛选出耐1%NaCl的野生烟草耐盐细胞系，在含盐培养基上培养多代仍保持稳定的耐盐性。Oono[27]用水稻种子诱导的愈伤组织直接培养在含1%NaCl的培养基中，得到了高频率的耐盐突变体植株，其后代也具有耐盐性。郑企成等[19]用含0.4%NaCl的培养基诱导冬小麦幼穗愈伤组织，在相同条件下继代1年后，以0.4%NaCl为一梯度，逐级升高选择浓度至2.0%。分化再生后获得21株植株，其中18株获得了种子，部分后代具有一定的耐盐性。米海莉等[28]用小麦成熟胚诱导产生胚性愈伤组织，采用恒定浓度筛选法和逐级筛选法进行耐盐突变体的筛选，将经过0.5%NaCl继代培养存活的愈伤组织转入相同含盐量的分化培养基上再生出植株，将再生植株后代种子播种到大田盐地，收获的种子加盐水培，得到了耐盐性幼苗。郑霞等[29]以玉米幼胚诱导出愈伤组织，采用多步选择法，在浓度为10～20 mg/L NaCl的N6选择培养基上连续选择3代，得到耐20 mg/L NaCl的愈伤组织变异体，进一步在分化培养基上分化出再生植株，其自交后代种子也具有耐盐性。还有在小麦[30-31]、番茄[32]中获得成功的报道。

2.2 分化得到耐盐再生植株，但其后代不耐盐或无后代

王仑山等[5]将枸杞无菌苗下胚轴诱导产生的胚性愈伤组织经0.34%EMS处理后，将存活愈伤组织转至1.5%NaCl培养基培养，再将存活组织转至含1.0%NaCl的相同培养基，筛选出耐1.0%NaCl的愈伤组织变异体，少数变异体在1.0%NaCl培养基分化出耐盐再生植株。周荣仁等[9]以烟草叶片为外植体，通过逐渐增加NaCl浓度的方法，获得耐2.0%NaCl的愈伤组织变异体，但耐2.0%NaCl的愈伤组织在2.0%NaCl的培养基中继代29次后再转入无盐培养基培养11和20代后不能保持2.0%NaCl水平的耐盐性，分别退化至耐1.5%和1.0%NaCl水平。耐2.0%NaCl的愈伤组织分化的植株，其自交后代的种子、幼苗、植株均未表现出耐盐性。冯桂苓等[16]采用逐渐增加NaCl浓度多次继代筛选法对水稻F2代成熟胚愈伤组织进行耐盐突变体筛选，最终获得了能在0.3%NaCl土壤中正常生长的4株耐盐株系。梁小红等[23]采用高盐直接筛选和逐步提高盐浓度筛选，对结缕草成熟胚进行耐盐愈伤组织筛选，将获得的生长旺盛的耐盐愈伤组织转入高盐分化培养基中，2种筛选方法获得了15个耐1.0%NaCl的株系和14个耐1.2%NaCl的株系。王兴军等[33]以成熟去皮的木槿种子诱导的无菌苗下胚轴为外植体诱导出愈伤组织，用逐步提高NaCl浓度的方法，获得了耐盐性稳定的细胞系，耐盐细胞系经分化培养获得了再生植株，再生植株具有耐盐性。另外，还有对小麦[34]、红豆草[35]、玉米[36]进行相关研究的报道。

2.3 得到耐盐愈伤组织，未获得耐盐再生植株

毛桂莲等[12]以枸杞叶片为外植体诱导出的愈伤组织用不同剂量的60Co γ射线进行照射，将恢复增殖的愈伤组织采用逐步提高含盐量的方法，获得了稳定的耐1.0% NaCl的愈伤组织变异体。岳玮等[37]将獐毛匍匐茎茎尖、子房、胚珠等为来源的原始型愈伤组织培养在2.0%NaCl的培养基上连续筛选，获得了耐2.0%NaCl的变异型愈伤组织，其在无NaCl培养基中长期培养后仍能耐2.0%NaCl。

2.4 其他

在盐胁迫过程中培养的植物组织或细胞会合成新的蛋白质，在沙打旺[17]、水稻[38]、小麦[39]等植物的培养组织或再生植株中发现了此种盐胁迫蛋白，进行了一些盐胁迫蛋白的亚细胞定位，某些酶的盐诱导合成和26 ku盐胁迫蛋白的分离、纯化、氨基酸顺序分析等研究。

研究者还对细胞和植株水平上耐盐突变体的K+、Na+、Cl-等离子吸收与耐盐性的关系进行了研究[37，40]，发现细胞中Na+浓度与耐盐性呈正相关，K+浓度与Na+浓度呈负相关。

在耐盐突变体筛选中研究较多的小分子有机物是脯氨酸，它是渗透胁迫过程中容易累积的一种氨基酸。研究证明，在盐胁迫过程中，细胞内游离脯氨酸的含量显著增加。如毫菊耐盐愈伤组织变异体在0.5%和1.0% NaCl胁迫下，游离脯氨酸含量急剧增加，分别是对照的14.2倍和48.9倍，在1.5%NaCl胁迫下，游离脯氨酸含量有所下降，但仍是对照的42.0倍[11]。在枸杞[5]、烟草[9]、獐毛[37]等植物中也有游离脯氨酸含量增加的报道。而在木槿耐盐细胞中，脯氨酸含量增加不显著[33]，与上述试验结果有所不同。而脯氨酸的积累与耐盐性的关系也一直存在争论，但脯氨酸的积累究竟是盐胁迫引起植物损伤的结果， 还是耐盐胁迫的原因， 目前尚不清楚。有学者认为脯氨酸的积累是耐盐的原因， 而不是盐胁迫的结果。Van Swaaij等[41]建立的土豆无性系在无盐胁迫条件下也能积累大量脯氨酸，其中有些细胞系确实具有较强的耐盐能力， 表明大量脯氨酸的积累可能具有对抗盐害的功能。而有学者认为脯氨酸的积累是盐胁迫的偶然性结果，如大豆在同样盐胁迫条件下，脯氨酸的积累是一种栽培特性，其含量与抗盐胁迫能力无相关性[42]。对高粱的研究发现，耐盐性与脯氨酸的积累也无相关性[43]。因此，脯氨酸的积累与耐盐性的关系有待深入研究。

酶是基因的产物，也是遗传学研究的重要手段，通过同工酶种类的变化，能了解基因产物的表达。对耐盐突变体同工酶、全蛋白变化的研究发现，耐盐植物的同工酶谱带与对照差异显著[38，44]，耐盐植物能产生特异表达蛋白[45]。

通过测定耐盐变异体Na+、K+等离子含量、脯氨酸含量和同工酶谱带等生理生化指标还不能充分说明它们发生了遗传变异，缺少分子水平的证据，而DNA分子遗传标记弥补了上述不足。目前多采用RFLP、AFLP、RAPD等标记进行耐盐突变体的分子鉴定，已成功在分子水平上鉴定的耐盐突变体有水稻[46]、小麦[47]、小黑麦[48]、豆瓣菜[49]、芦苇[50]、大豆和苜蓿[51]等。

利用组织培养技术筛选植物耐盐突变体，草本植物研究较多，木本植物研究较少，其中杨树研究较多，其他树种研究较少。目前已对不同杨树品种[52-58]、中华猕猴桃[8]、木槿[15，33]、樱桃[59]、柑橘[60]、苹果砧木[61]进行耐盐突变体筛选方面的研究。

3 问题与展望

目前，筛选耐盐突变体的研究取得了一些进展，但也存在诸多问题，尚需进一步探索和研究。

所得到的大多数愈伤组织或细胞系的耐盐性和再生植株的耐盐性并不一致或只是部分相关，即愈伤组织或细胞系表达的基因在其再生植株中不一定能表达。植物的耐盐性是十分复杂的数量性状，是多性状的综合表现，受到多基因控制，基因表达的数目和程度在植株与细胞2种水平上可能有些差异，使得2种水平的耐盐性不完全一致。也有些植物如小麦、番茄等在2种水平的耐盐性一致，此类植物容易从细胞水平筛选耐盐品系。

由于长期继代培养，耐盐细胞系表现出明显的盐毒害作用，严重丧失分化能力，难已分化再生植株，即便分化，植株也多为畸形，移栽至土壤中成活率极低，而存活下来的也多为不育植株，难以获得种子。因此，筛选耐盐突变体应建立能长期保持高频率再生分化能力的无性系，不断完善耐盐筛选的程序，使耐盐细胞系在长期选择后仍具有较高的再生分化能力。

筛选耐盐突变体过程中，利用离体培养的器官、组织等材料进行诱变处理会出现嵌合体，为突变体筛选和鉴定增加了难度，且突变频率很低，影响筛选效率，而利用悬浮细胞可以很好地解决此问题，但悬浮培养技术难度大，需加强该方面的研究。

当前筛选耐盐突变体只是针对耐盐性状的研究，很少考虑到育性、品质、产量等方面性状，随着科学技术的不断进步，将耐盐突变体育种同常规育种和基因工程的手段相结合，以期培育出耐盐碱、优质、丰产的优良品种，更好地为农林业生产发展服务。

我国具有大面积以碳酸盐、硫酸盐以及混合盐为主的盐渍土，目前研究多是以NaCl为选择剂筛选耐盐突变体，即使获得了耐盐植株，其是否能在其他类型盐渍土上长期正常生长尚未知，所以应开展耐其他类型盐分突变体筛选的研究。

作为对保护和改善生态环境具有重要意义的林木，利用组织和细胞培养技术对其进行耐盐突变体筛选研究较少，可尝试应用此技术进行耐盐突变体筛选的研究，以期筛选出耐盐碱的林木。

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