机械损伤对茶树苯丙氨酸解氨酶活性及茶多酚含量的影响

吴琼　方吴云　王文杰

摘要 [目的]明确机械损伤对不同茶树无性系品种叶片和新梢苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性及茶多酚含量的影响。[方法]以茶树无性系良种舒茶早、凫早2号、福鼎大白茶为试验材料，采用分光光度计法测定正常茶树叶片中PAL活性和茶多酚含量变化的月节律，以及机械损伤诱导叶片和新梢PAL活性和茶多酚含量的时序变化。[结果]各品种未做任何损伤处理时，PAL酶活之间无明显差异，机械损伤1 h后，不论是轻修剪还是重修剪，3个品种间的PAL酶活均差异极显著；机械损伤对茶多酚含量的影响较PAL酶活有时间上的延迟；机械损伤对茶树新梢的PAL酶活和茶多酚含量有一定的影响，并且对不同品种的影响不同。[结论]试验结果为进一步探讨机械损伤对茶树生长和抗逆性的影响及其生理生化应答机理提供了参考。

关键词 茶树；机械损伤；PAL酶；茶多酚

中图分类号 S571.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2016）05-011-04

Abstract[Objective]The aim was to determine effects of mechanical wounding on PAL activity and tea polyphenol of leaves and new branch of different tree plants.[Method]By using Shu Chazao， Fuzao 2 and Fuding Dabai tea as test materials， adopting spectrophotometer method， PAL activity and content of tea polyphenol of normal tea plant and mechanical wounding leaves and new branch were measured[Result]The result showed there was no significant difference in PAL activity between 3 varieties without any damage. In 1h after mechanical damage， difference is significant at the 0.01. Compared with PAL activity， the amount of polyphenol changed later. The PAL activity and the amount of polyphenol in new shoots was influenced by mechanical damage， and it was different in different varieties.[Conclusion]The experiment results provide reference for further discussing effects of mechanical wounding on tea plant growth and resistance， as well as physiological growth response mechanism.

Key words Tea plant； Mechanical wounding； Phenylananine ammonialyase； Tea polyphenol

植物遭受机械损伤后产生一系列次生代谢物质如酚类、黄酮类、萜类、生物碱等，集中在伤口及其附近部位，参与伤愈合反应和抵抗昆虫或病菌的入侵[1]。这些次生代谢物质主要通过苯丙烷类代谢途径生成，苯丙氨酸解氨酶（Phenylananine ammonialyase，PAL，EC4.3.1.5）是催化这一途径的关键酶，在植物生长发育、防紫外辐射、抵御病虫害和构成植物支撑系统等方面具有重要的意义和价值，其活性可以作为衡量植物抗逆性强弱的指标[2]。由于酚类物质在植物抗生物胁迫机制中起着重要作用，PAL又被视为重要的防御酶，机械损伤也被认为是诱导植物防御的重要手段之一[3]。

植物从感受伤刺激到PAL基因表达之间存在一系列的信号传递转换过程。已有研究表明，茉莉酸类化合物（JAs）是伤反应信号转导途径中必不可少的信号分子[4]。而PAL的表达调控机制非常复杂，但国内外对植物PAL的研究集中在它的提取纯化、抗逆境、抗病虫害、生理作用等方面，关于其基因表达和调控方面的研究较少，对PAL的表达调控机理尚不清楚。目前，已报道了多种植物PAL的启动子结构，但有关PAL转录因子的研究报道较少。目前公认的是R2R3MYB转录因子正调节和负调节苯丙烷代谢途径中的合成酶，也可以对伤害进行应答[5-6]。

茶树作为一种多年生常绿叶用经济作物，不断遭受人为损伤（采摘及修剪），过度的机械损伤会加速茶树的衰老，直接影响鲜叶的内含成分、鲜叶的适制性和成茶品质。鉴于此，笔者以不同茶树无性系品种为试验材料，研究了机械损伤后茶树叶片和茶树新梢的PAL酶活及茶多酚含量的变化，以期为探讨机械损伤对茶树生长和抗逆性的影响及其生理生化应答机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验品种。福鼎大白茶、凫早二号、舒茶早。

1.1.2 试剂与仪器。

没食子酸（GA）标样购自安徽合肥博美公司；福林肖卡试剂购自美国Sigma公司；植物苯丙氨酸解氨酶试剂盒（Elisa）购自上海源叶生物科技有限公司。SUNRISE酶标仪，Tecan公司；RT3100全自动洗板机，雷杜公司；DHP9082型电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；756紫外分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司。

1.2 试验方法

试验在安徽省农业科学院茶叶研究所资源圃进行。资源圃中均为同期栽种的成年茶树。每个品种面积为10 m×20 m。2015年6月5日进行机械损伤处理，其中处理①剪去新梢绿杆，简称为轻修剪；处理②剪去新梢红杆，简称为重修剪；对照不做任何处理。每个处理设置3次重复。在机械损伤后以损伤枝上第1片完整无损的成熟叶片为样品材料，以1个月为周期，连续采摘8次，采摘间隔依次为机械损伤后1 h、4 h、8 h、24 h、72 h、7 d、15 d、30 d。机械损伤35～40 d取损伤枝上萌发的1芽2叶新梢为样品材料。样品采集后置于液氮中迅速冷冻，保存于-40 ℃冰箱中备用。

1.3 测定指标与方法

茶多酚含量测定采用福林酚比色法，参照GB/T 8313-2008，结果以鲜重质量分数（%）表示。

苯丙氨酸解氨酶含量测定参照植物L苯丙氨酸解氨酶ELISA检测试剂盒使用说明书，结果以U/g记。

1.4 数据处理

采用SPSS软件中的方差分析方法对试验数据进行分析。茶树不同机械损伤处理间、不同品种间叶片与新梢PAL酶活与茶多酚含量的比较采用最小显著差异t检验。

2 结果与分析

2.1 机械损伤对茶树叶片中PAL活性的影响

2.1.1 不同处理对茶树叶片PAL活性的影响。由图1～3可知，不做任何处理时，在1个周期内，3个品种叶片PAL酶活有较大幅度的波动。机械损伤后，3个品种PAL酶活的变化趋势与对照有明显不同。舒茶早、凫早2号、福鼎大白茶在轻修剪1 h后PAL酶活均高于对照；舒茶早和凫早2号在重修剪1 h后PAL酶活高于对照，4 h后对照PAL酶活性增加，机械损伤后的PAL活性均有所下降；舒茶早与福鼎大白茶不同机械损伤处理后叶片PAL酶活有相似的变化趋势，均先小幅增长后下降，在7 d时PAL酶活达到一个最大值，到30 d时舒茶早对照的PAL酶活大幅度增长，机械损伤后的PAL酶活却下降，而福鼎大白茶在15 d后3种处理的PAL酶活已趋同；凫早2号叶片PAL酶活对不同机械损伤处理的响应不同，轻修剪的PAL酶活在1 h时迅速升高至最高点，而重修剪的PAL酶活在8 h时才达到峰值。

单因素方差表明，各品种未做任何损伤处理时，PAL酶活之间不存在明显差异，机械损伤1 h后，不论是轻修剪还是重修剪，3个品种PAL酶活均差异显著；重修剪72 h后，3个品种间PAL酶活差异显著。

对不同品种机械损伤后PAL酶活随时间变化的LSD分析结果表明，轻修剪1 h后，凫早2号PAL酶活与舒茶早、福鼎大白茶间差异显著；重修剪1 h后，凫早2号PAL酶活与福鼎大白茶差异显著，福鼎大白茶与舒茶早间差异显著；重修剪72 h后，凫早2号PAL酶活与福鼎大白茶差异显著。

2.1.2 不同处理对茶树新梢PAL活性的影响。由图4可知，机械损伤处理后各品种的新梢PAL酶活均低于对照，3个品种中以凫早2号的新梢PAL酶活性最高，福鼎大白茶的新梢PAL酶活性最低。

2.2 机械损伤对茶树叶片茶多酚含量的影响

2.2.1 不同处理对茶树叶片茶多酚含量的影响。

由图5～7可知，机械损伤后，不论是轻修剪还是重修剪，在24 h内，3个品种的茶多酚含量均低于对照；轻修剪处理后舒茶早的茶多酚含量上升，在72 h时高于对照，同时重修剪处理后福鼎大白茶的茶多酚含量也上升，高于对照；在7 d时，舒茶早的茶多酚含量下降至最低点，对照的茶多酚含量比轻修剪低，比重修剪高，之后茶多酚含量又迅速升高；凫早2号机械损伤后，不论是轻修剪还是重修剪，茶多酚含量均低于对照，机械损伤处理后茶多酚含量的变化趋势与对照相似；与舒茶早不同的是，在机械损伤后7 d，凫早2号对照和重修剪的茶多酚含量升高到峰值，而轻修剪降低至最低点；福鼎大白茶对照与轻修剪的茶多酚含量最低点出现在机械损伤后72 h，重修剪的茶多酚含量最低点在机械损伤后8 h。

2.2.2 不同处理对茶树新梢茶多酚含量的影响。由图8可知，机械损伤对不同品种茶树新梢茶多酚含量的影响不同，凫早2号不论是轻修剪还是重修剪的新梢茶多酚含量均高于对照；福鼎大白茶不论是轻修剪还是重修剪的新梢茶多酚含量均低于对照；舒茶早轻修剪的新梢茶多酚含量高于对照，而重修剪的新梢茶多酚含量低于对照，各处理间差异显著，其中重修剪新梢茶多酚含量与对照及轻修剪的新梢茶多酚含量差异显著。

2.3 机械损伤后茶树叶片PAL活性与茶多酚含量的相关性分析

2.3.1 不同处理间茶树叶片PAL活性与茶多酚含量的相关性。

凫早2号轻修剪后茶树叶片的PAL活性与茶多酚含量显著负相关（r=-0.517）；无论是对照还是机械损伤对茶多酚含量的影响相对PAL酶活都有时间上的延迟，对照8 h的PAL酶活与30 d时茶多酚含量显著负相关（r=-0.777），15 d的PAL酶活与30 d时的茶多酚含量显著负相关（r=-0.889）；轻修剪1 h的PAL酶活与8 h的茶多酚含量显著负相关（r=-0.702），与15 d的茶多酚含量显著负相关（r=-0.695）；轻修剪4 h的PAL酶活与7 d的茶多酚含量显著正相关（r=0.979）；轻修剪72 h的PAL酶活与72 h的茶多酚含量显著负相关（r=-0.726）；轻修剪30 d的PAL酶活与4 h的茶多酚含量显著正相关（r=0.825）。重修剪1 h的PAL酶活与72 h的茶多酚显著负相关（r=-0.766）；重修剪4 h的PAL酶活与72 h的茶多酚显著负相关（r=-0.951）。

2.3.2 不同处理间茶树叶片PAL活性、茶多酚含量与新梢PAL活性、茶多酚含量的相关性。

机械损伤对茶树新梢的茶多酚含量有一定的影响，轻修剪新梢茶多酚含量与轻修剪8 h的PAL酶活显著负相关（r=-0.807），重修剪新梢茶多酚含量与重修剪72 h的PAL酶活显著负相关（r=-0.870），与15 d的PAL酶活显著正相关（r=0.733），与24 h的茶多酚含量显著负相关（r=-0.782），与72 h的茶多酚含量极显著负相关（r=-0.798）。

3 结论与讨论

该研究从生理生化方面比较了茶树不同机械损伤程度成熟叶片与新梢的茶多酚与PAL随时间变化的差异，为探明茶树机械损伤诱导防御系统反应的机制提供了理论支撑；初步探讨了机械损伤对茶树新梢的生理生化影响，对进一步研究机械损伤对茶叶质量与品质的影响有一定的指示作用；研究了不同品种的机械损伤诱导防御反应在PAL酶活与酚类物质上的积累差异，表明不同品种对机械损伤的防御反应程度不同，存在种质特异性，为种质早期鉴定指明了研究方向。

该研究表明，茶树叶片PAL酶活对机械损伤后的响应是快速的，相比PAL酶活的急速变化，茶多酚含量的变化有所延迟，变化的程度也较平稳，而且与PAL酶活有此消彼长的趋势。机械损伤直接刺激植株，较其他方式更快启动苯丙烷类代谢途径，促进生成大量的PAL酶，大量的PAL酶促进酚类的形成，酚类物质的积累又反馈抑制PAL酶的合成。适量酚类的形成有助于植株的抗病虫害能力[7-8]，而过量酚类物质的积累对植株又是有害的，可加速植株的老化，并且对农业生产不利，影响产品的风味、质地和营养价值等。

目前，机械损伤诱导茶树防御反应机制仍有一系列问题亟待解决。例如，茶树受伤后，PAL活性诱导中的正负调控因子尚不明确；调控因子与转录因子的结合如何调控酚类物质的生物合成。解决上述问题，有助于进一步探明机械损伤诱导PAL酶活与酚类物质积累的机制。

参考文献

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[7]方海涛，段立清.机械损伤诱导林木抗虫性研究进展[J].西北林学院学报，2011，26（6）：91-94.

[8]胡增辉.合作杨苗木诱导抗性产生的生理生化基础研究[D].北京：北京林业大学，2007.