中国东北地区人群非综合征唇腭裂与PAX7基因的相关性

卢永平，李增健，胥威，刘巍，赵宁，隋钰，冯文华，马超，蔺美娜，韩维田

（1.辽宁省计划生育科学研究院生殖健康和医学遗传学重点实验室，沈阳110031；2.中国医科大学附属口腔医院口腔外科，沈阳110002）



中国东北地区人群非综合征唇腭裂与PAX7基因的相关性

卢永平1，李增健2，胥威1，刘巍1，赵宁1，隋钰1，冯文华1，马超1，蔺美娜1，韩维田1

（1.辽宁省计划生育科学研究院生殖健康和医学遗传学重点实验室，沈阳110031；2.中国医科大学附属口腔医院口腔外科，沈阳110002）

摘要目的探讨rs742071、rs7632427和rs12543318 3个单核苷酸多态（SNP）位点与非综合征唇腭裂（NSCL/P）发生的相关性。方法收集东北地区NSCL/P患者258例，患者父亲164例，患者母亲195例，共134个完整核心家系和300例正常对照样品，用PCR-RFLP方法进行基因分型，对分型结果用SPSS统计学软件进行统计分析。结果PAX7基因的rs742071的GT基因型和T等位基因在病例对照组中分布有统计学差异，并且FBAT分析结果显示T等位基因在核心家系中发生了过渡传递。rs7632427和rs12543318的基因分型结果无统计学差异。结论rs742071与中国东北地区人群NSCL/P的发生相关。

关键词PAX7；非综合征唇腭裂；单核苷酸多态

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非综合征唇腭裂（nonsyndromic c1eft 1ip with or without c1eft pa1ate，NSCL/P）是最常见的出生缺陷［1］。Mango1d等［2］的研究发现17q22的rs227731和10q25.3的rs7078160也是NSCL/P的易感基因位点。Beaty等［3］以亚洲、欧洲和美国等多个人群的1 965个核心家系为研究对象进行了GWAS研究，报道了2个新的易感基因位点MAFB和ABCA4。Ludwig等［4］基于Beaty和Mango1d的研究进行了meta分析，发现了3个与亚洲人群相关的新位点。

rs742071（1p36），rs7632427（3p11.1），和rs12543318（8q21.3）是3个新报道的与亚洲人群NSCL/P发生密切相关的基因位点，目前未见中国东北人群的研究报道。本研究以中国东北地区NSCL/P病例为研究对象，对这3个单核苷酸多态（sing1e nuc1eotide po1ymorphism，SNP）位点进行进一步的精确验证，以探讨其在NSCL/P发生中的作用。

1　材料与方法

1.1研究对象

选择中国医科大学附属口腔医院口腔外科确诊为NSCL/P的手术患者258例，患者父亲164例，患者母亲195例，其中134例患者为NSCL/P核心家系（NSCL/P组）。所有患者都进行了手术前检查和问卷调查，排除腭心面综合征、范德伍德综合征、歌舞伎面谱综合征、Mecke1综合征等。所有研究对象均签署了知情同意书，无行为能力的婴儿由监护人签署知情同意书。对照组样品收集本院体检的健康人群300例，所有受试者抽取5 mL静脉血，EDTA抗凝管-20℃保存。

1.2实验仪器和试剂

血液基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；PCR扩增试剂盒（天根生化科技有限公司）；PCR引物（表1）用Primer 5.0软件设计，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。MwoⅠ、BccⅠ、Hpy188Ⅲ限制性内切酶购自NEB生物科技公司。用Nano Drop 1000紫外分光光度计测定核酸浓度，PCR反应在ABI Veriti热循环仪（AB）上完成。

1.3SNP基因分型取200 μL患者血液，按照血液基因组提取试剂盒说明书抽提DNA，紫外分光光度计测定核酸浓度，标准化为50 ng/μL。PCR反应体系如下：DNA 1 μL（50 ng/μL），正义链和反义链引物各0.8 μL（10 μmo1/L），dNTP mix 1.6 μL，DNA聚合酶缓冲液2 μ L，Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O补充至20 μL。PCR 循环条件为94 ℃变性5 min，然后94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，循环35 次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃终止延伸。rs742071（1p36） ， rs7632427 （3p11.1） ， 和rs12543318（8q21.3）的PCR产物分别由MwoⅠ、BccⅠ、Hpy188Ⅲ限制性内切酶进行酶切，酶切反应如下：PCR产物1 μL，内切酶0.2 μL，内切酶缓冲液1 μL，加水至10μL，37 ℃孵育2 h。酶切后行8％非变性PAGE凝胶电泳进行基因分型。

表1　PCR引物序列Tab.1 The primer sequence of PCR

1.4统计学分析

用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。对患者父母及对照组病例进行Hardy-Weinberg平衡检验。计算NSCL/P组和对照组中各位点的基因型和等位基因频率的差别，并进行χ2检验，计算出OR值和95%可信区间。用FBAT 5.5软件分析包对患者及父母核心家系进行复杂疾病家系关联性遗传分析。

2　结果

2.1SNP的基本信息及Hardy-Weinberg平衡检验

本研究检测的3个SNP位点的基本信息见表2，包括相关基因，染色体位置，所处功能区域，碱基变化和对照组的Hardy-Weinberg平衡检验结果。对照组的基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡检验（P＞0.05），说明数据来自同一孟德尔群体。

2.2基因分型结果

表2　SNP位点基本信息及Hardy⁃Weinberg平衡检验结果Tab.2 Basic information of SNP locus and the result of Hardy⁃Weinberg disequilibrium test

NSCL/P组与对照组基因分型结果见图1。图中M泳道为DL2000 marker，图1A中1、4泳道为GT基因型样品，酶切形成283 bp、221 bp、62 bp 3个片段，2、3、5、6泳道为GG基因型样品，酶切形成221 bp和 62 bp 2个片段。图1B中1泳道为CC基因型样品，酶切后只有1条269 bp片段，2、4、5泳道为CT基因型样品，酶切后形成269 bp、105 bp、164 bp 3个片段，3、6泳道为TT基因型样品，酶切后形成105 bp和164 bp 2个片段。图1C中1、3、4泳道为AC基因型样品，酶切后形成134 bp、36 bp、98 bp 3个片段，2泳道为AA基因型样品，酶切后只有1条134 bp片段，5、6泳道为CC基因型样品，酶切后形成36 bp、98 bp 2个片段。

图1　基因分型结果Fig.1 Results of genotype

基因型、基因频率的统计分析结果见表3。可以看出，rs742071位点上，NSCL/P组的GT基因型频率［P= 0.013，OR=2.29（1.169～4.485）］和等位基因频率［P= 0.015，OR=2.22（1.147～4.300）］均高于正常对照组，差异有统计学意义。rs7632427的CT、CC基因型频率分别与TT基因型比较无统计学差异（P＞0.05），等位基因T和C在NSCL/P组和正常对照组中分布也无统计学差异（P＞0.05）。rs12543318位点上，NSCL/P组的AC基因型比正常对照组稍高，具有统计学差异（P= 0.048），AA基因型在2组间差异不明显（P＞0.05），A等位基因频率在2组间分布也无统计学差异。

2.3FBAT分析

FBAT分析结果显示，rs742071位点的T等位基因从父母过渡传递到孩子，表明T等位基因与NSCL/P发生相关，rs7632427和rs12543318位点的等位基因没有发生过渡传递。见表4。

3　讨论

近期进行的多个全基因组关联分析发现了很多与NSCL/P相关的新的基因和位点，Ludwig等［4］基于2个较大的GWAS研究结果进行了meta分析，结果验证了之前报道的95%的与NSCL/P发生相关的基因，并且确定了6个新的易感基因，其中rs742071 （1p36），rs7632427（3p11.1）和rs12543318（8q21.3）位点与亚洲人群的NSCL/P发生相关，而rs7590268，rs8001641和rs1873147 3个位点与欧洲人群的NSCL/P发生相关。

1p36的rs742071位点位于PAX7基因的内含子区域，而PAX7基因在颅面发育过程中起重要的作用［5］，Su11等［6］在不同人群中以病例-父母核心家系为研究对象，调查了PAX7基因上的7个SNP变异与NSCL/P的关系，研究结果显示其中2个变异从父母过度传递给患儿，表明PAX7的变异可能与NSCL/P发生相关。本研究发现GT基因型（P= 0.013）和G等位基因频率（P= 0.015）在NSCL/P组和正常对照组中的分布存在统计学差异，其中携带GT基因型患NCSL/P的风险是GG基因型的2.29倍。FBAT分析结果显示rs742071的T等位基因由父母过渡传递给孩子（P= 0.016）。以上结果表明，rs742071的GT基因型与NSCL/P的发生相关，并且T等位基因是NSCL/P发生的危险因素。本研究的结果与Su11的研究结果一致，说明PAX7可能是NSCL/P的易感基因。

3p11.1的rs7632427位点位于EPHA3基因的3’UTR区域。Agrawa1等［7］通过小鼠的胚胎表达研究发现EPHA家族基因可能是NSCL/P发生的1个因素。本研究中，没有发现该位点的基因型和等位基因频率的统计学差异，FBAT传递分析结果同样没有发生过渡传递现象，表明该位点可能与NSCL/P的发生不相关。8q21.3的rs12543318位点附近没有相关的基因。本研究中，AC vs CC和AC+AA vs CC的P＜0.05，但是，NSCL/P组的基因频率分布没有明显的统计学差异，FBAT显示该位点没有过渡传递现象的发生，说明该位点可能与NSCL/P的发生关联不大。Pan等［8］在中国东部人群的研究同样发现该2个位点与NSCL/P的发生不相关，但认为NSCL/P的发生与包含该2个位点在内的6个SNP位点的变异积聚效应有关，发生变异的等位基因数量越多，则越容易发生NSCL/P，当7～8个等位基因发生突变时，NSCL/P的发生风险是0～2个突变的12.67倍。所以尽管本研究中该2个位点与NSCL/P的发生都没有相关性，但是并不排除它们与其他SNP位点相互作用引起NSCL/P。

表3　rs742071、rs7632427和rs12543318的基因型和基因频率统计分析结果Tab.3 The statistic analysis result of genotype and gene frequency of rs742071，rs7632427 and rs12543318

表4　rs742071、rs7632427和rs12543318的FBAT统计分析结果Tab.4 The FBAT statistic analysis result of rs742071，rs7632427 and rs12543318

本研究分析了rs742071（1p36），rs7632427 （3p11.1），和rs12543318（8q21.3）3个位点与NSCL/P发生的相关性，发现rs742071的GT基因型和T等位基因可能是NSCL/P发生的因素。尽管rs7632427和rs12543318位点与NSCL/P的发生没有直接相关性，但是也可能与其他基因相互作用进而导致NSCL/P的发生。当然本研究存在样品量和分析位点少的不足，希望在将来的研究中，能够纳入更多的研究对象和研究位点，进而更好的发现NSCL/P发生的原因。

参考文献：

［1］Dixon MJ，Marazita ML，Beaty TH，et a1. C1eft 1ip and pa1ate：understanding genetic and environmenta1 inf1uences［J］. Nat Rev Genet，2011，12（3）：167-178.

［2］Mango1d E，Ludwig KU，Birnbaum S，et a1. Genome-wide association study identifies two susceptibi1ity 1oci for nonsyndromic c1eft 1ip with or without c1eft pa1ate［J］. Nat Genet，2010，42（1）：24-26.

［3］Beaty TH，Murray JC，Marazita ML，et a1. A genome-wide association study of c1eft 1ip with and without c1eft pa1ate identifies risk variants near MAFB and ABCA4［J］. Nat Genet，2010，42（6）：525-529.

［4］Ludwig KU，Mango1d E，Herms S，et a1. Genome-wide meta-ana1yses of nonsyndromic c1eft 1ip with or without c1eft pa1ate identify six new risk 1oci［J］. Nat Genet，2012，44（9）：968-971.

［5］Mansouri A，Stoykova A，Torres M，et a1. Dysgenesis of cepha1ic neura1 crest derivatives in Pax7-/- mutant mice［J］. Deve1opment，1996，122（3）：831-838.

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［8］Pan Y，Han Y，Zhang H，et a1. Association and cumu1ative effects of GWAS-identified genetic variants for nonsyndromic orofacia1 c1efts in a Chinese popu1ation［J］. Environ Mo1 Mutagen，2013，54（4）：261-267.

（编辑于溪）

Associationbetween Nonsyndromic Cleft Lipwithorwithout Clept Palateand PAX7in Northeastern Chinese People

LUYongping1，LIZengjian2，XUWei1，LIUWei1，ZHAONing1，SUIYu1，FENGWenhua1，MAChao1，LINMeina1，HANWeitian1
（1. Liaoning Province Research Institute of Fami1y P1anning Key Laboratory of Reproductive Hea1th and Medica1 Genetics，Shenyang 110031，China；2. Department of Ora1 Surgery，The Affi1iated Stomato1ogica1 Hospita1，China Medica1 University，Shenyang110002，China）

AbstractObjective To investigate the re1ationship between NSCL/P and three SNPs inc1uding rs742071，rs7632427 and rs12543318. Methods A tota1 of 134 tri-fami1y and 300 common contro1s were recruited for the study，inc1uding 258 NSCL/P patients，164 cases of patient’s father，and 195 cases of patient’s mother. PCR-RFLP was used to genotype the three SNPs，and the resu1t was ca1cu1ated by SPSS package. Results The distribution of GT genotype and T a11e1ic gene of rs742071 was statistica1 different. The FBAT resu1t a1so showed that over transmission of T a11e1ic gene from parents to chi1d. However，no statistica1 differences of rs7632427 and rs12543318 were observed. Conclusion There is corre1ation between rs742071and NSCL/Pinnortheastern Chinesepeop1e.

KeywordsPAX7；nonsyndromic c1eft 1ip with or without c1eft pa1ate；SNPs

中图分类号R728

文献标志码A

文章编号0258-4646（2016）06-0522-04

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.011

基金项目：辽宁省科技攻关项目（2009225007-7）；辽宁省自然科学基金（201102247）

作者简介：卢永平（1983 -），男，助理研究员，硕士.

通信作者：韩维田，E-mai1：HWTZZF@sohu.com

收稿日期：2016-03-03