大黄牡丹汤对肠道菌群的体外作用

郑彦懿，温如燕，罗霞，周联（广州中医药大学中药学院，广东广州　510006）



大黄牡丹汤对肠道菌群的体外作用

郑彦懿，温如燕，罗霞，周联
（广州中医药大学中药学院，广东广州510006）

摘要：【目的】观察大黄牡丹汤对肠道菌群结构及功能的影响。【方法】分别采用16S rDNA测序法、平板计数法和气相色谱法考察大黄牡丹汤对肠道菌群及其分泌短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）功能的影响。【结果】16S rDNA测序结果表明拟杆菌属、埃希菌属细菌明显减少，乳杆菌属、乳球菌属、变形菌属细菌增多。平板计数结果表明大黄牡丹汤能显著抑制脆弱拟杆菌体外增殖（P＜0.001）。气相色谱法检测结果表明大黄牡丹汤可显著抑制SCFAs的分泌（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。【结论】肠道菌群及其代谢产物可能是大黄牡丹汤发挥药效的靶点。

关键词：大黄牡丹汤/药理学；拟杆菌属；脆弱拟杆菌；短链脂肪酸；16S rDNA测序；色谱法，气相

研究［1-4］发现，肥胖、Ⅱ型糖尿病、肠应激综合征、炎症性肠病等多种疾病的发生、发展均与肠道菌群密切相关，据此推测肠道菌群可以作为药物治疗疾病的作用靶点。传统中药多为复方汤剂，其成分复杂，故中药作用机制常受到质疑。大黄牡丹汤出自《金匮要略》，是治疗肠痈的经典方。该方由大黄、牡丹皮、桃仁、冬瓜仁和芒硝组成，现代临床常用于治疗溃疡性结肠炎［5］、急性阑尾炎［6］等炎症疾病。本研究通过观察大黄牡丹汤对肠道菌群及其代谢产物的体外影响，为阐明大黄牡丹汤作用机制提供依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1动物SPF级BALB/c小鼠2只，雄性，体质量18～22 g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2013-0002。

1.2药物与试剂大黄（四川产，批号：HX14B01）、牡丹皮（安徽产，批号：VPA4G001）、桃仁（四川产，批号：131201921）、冬瓜仁（广东产，批号：150308721）、芒硝（青海产，批号：150403621）均均购于广东省中医院；标准品：乙酸（200 mmol/L，批号：E1430023）、丙酸（100 mmol/L，批号：E1413034）、丁酸（100 mmol/L，批号：F1508160）、大黄素（≥960 mg/g，批号：L1408020）均购于美国Aladdin公司；脆弱拟杆菌（编号：ATCC 25285）购于上海复祥生物科技有限公司；脑心浸液肉汤（批号：20140708）、胰蛋白大豆琼脂（批号：20141118）购于青岛高科园海博生物技术有限公司；硫氰酸胍（批号：G6636）、N-月桂酰肌氨酸（批号：L9150）、交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP，批号：PB0436）购于美国Sigma公司；Tris-HCl（批号：TB0194）、乙二胺四乙酸（EDTA，批号：15575-038）、醋酸钠（批号：AM9740）、醋酸钾（批号：AM9610）购于美国Ambion公司；Phusion High-Fidelity PCR Master Mix购于美国NEB公司；Agencourt Ampure XP beads购于美国Beckman Coulter公司；Eva Green qPCR Master Mix购于美国Biotium公司；MiSeq Reagent Kit购于美国Illumiina公司；无菌去纤维羊血（批号：150729）购于广州蕊特生物科技有限公司。

1.3仪器及其他材料BSA224S电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；SW-CJ-2FD超净工作台（苏净安泰公司）；DHP-9272电热恒温培养箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；tissue lyserⅡ样品破碎系统（德国Qiagen公司）；5427R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；2100生物芯片分析系统（美国Agilent公司）；麦氏比浊管（批号：5103184，广东环凯微生物科技有限公司）；GC2010 Plus气相色谱仪配备：AOC-20i自动进样器、GH-400氢气发生器（日本岛津公司）。

1.4药液的制备大黄牡丹汤原方除芒硝外加水600 mL浸泡20 min，武火煎煮1 h，过滤，再加水300 mL，煎煮30 min，合并药液后加入芒硝，待其充分溶解后浓缩至生药量1 g/mL，4℃储存。

1.5大黄牡丹汤对肠道菌群多样性的影响

1.5.1小鼠盲肠内容物的培养无菌取小鼠盲肠内容物约0.1 g于EP管中，加9倍量无菌生理盐水，涡旋均匀，此肠菌液稀释度为10-1，稀释10倍得到10-2肠菌液，备用。配制脑心浸液肉汤，分为需氧菌组和厌氧菌组（液面添加液体石蜡）。以上2组试管又各分为给药组和空白组，给药组加入大黄牡丹汤（终浓度分别为2、4、8 mg/mL），空白组加入等量磷酸盐缓冲液（PBS）。定量接种10-2肠菌液至试管中，混匀，封口；37℃培养48 h后，吸弃液体石蜡，等比例混合需氧菌菌液和厌氧菌菌液，离心（3 500 r/min，10 min，4℃），弃上清，于-80℃保存，备用。

1.5.2肠道菌群DNA的提取从-80℃冰箱取出细菌样品，加入适量硫氰酸胍和N-月桂酰肌氨酸，70℃水浴1 h后，加入玻璃珠，震荡分散，离心（12 000 r/min，5 min，4℃）。转移上清至EP管中，加TENP buffer，涡旋，离心（12 000 r/min，5 min，4℃）。吸上清至新Ep管中，沉淀重复上一步操作，共4次。收集所有上清至2个异丙醇管中，置4℃过夜，离心（12 000 r/min，15 min，4℃）。弃上清，在其中1个异丙醇管中加入磷酸缓冲液和醋酸钾，混匀后转入另1个异丙醇管，混匀，于冰上静置1.5 h，离心（12 000 r/min，30 min，4℃），加无水乙醇和醋酸钠，于-20℃放置1 h，离心（13 260 r/min，10 min，4℃）。弃上清后加入体积分数70%乙醇，常温离心（12 000 r/min，5 min）并重复此步骤。加入TE buffer混匀，得到DNA模板样品。

1.5.316S rDNA扩增及测序取样品模板DNA30 ng，按试剂盒说明书进行PCR。反应条件：预变性：94℃，3 min；变形：94℃，10 s；退火：56℃，30 s；30个循环。按试剂盒说明书纯化PCR产物。检测DNA分子长度并按试剂盒说明书进行定量后，经MiSeq系统进行基因测序。

1.6大黄牡丹汤对肠道菌群短链脂肪酸（SCFAs）的影响

1.6.1气相色谱条件色谱柱：RTX-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：230℃；载气：氮气，纯度≥99.999%；载气流速3.0 mL/min；进样方式：无分流进样，进样量为2.0 μL；检测器温度（FID）：250℃；柱温程序：。

1.6.2标准曲线的制备分别吸取乙酸、丙酸、丁酸对照品2.5、5、25、50、100 μL，等体积混合于进样瓶中并标记，加乙醚至1 mL，共5瓶。另取乙酸对照品500 μL，加乙醚至1 mL，共1瓶。又分别取乙酸、丙酸、丁酸对照品各1 mL，共3瓶，以上9个样品均上机检测。根据乙酸、丙酸、丁酸的浓度与峰面积关系制备标准曲线。

1.6.3样品的制备取1.5.1项下培养后的厌氧菌菌液，吸弃液体石蜡，混匀培养基，离心（3500r/min，10 min，4℃）。取2 mL上清，加入10 mol/L的H2SO4200 μL进行酸化，加入2 mL无水乙醚，混匀后静置15 min，室温离心（3 000 r/min，15 min）。转移上清至气相进样瓶中，按1.6.1色谱条件上机检测。

1.7大黄牡丹汤对脆弱拟杆菌增殖的影响常规方法复苏脆弱拟杆菌菌株后，采用比浊法［7］调整菌液浓度为106个/mL。在培养基中加入大黄牡丹汤（终浓度为2、4、8 mg/mL），空白组加入等量PBS。定量接种菌液，涂布均匀后，37℃厌氧培养48 h，进行菌落计数，结果以菌落形成单位（CFU）的对数值表示。

1.8大黄牡丹汤对脆弱拟杆菌SCFAs的影响配制脑心浸液肉汤（液面添加液体石蜡），加入大黄牡丹汤（终浓度分别为2、4、8 mg/mL），空白组加入等量PBS。加入脆弱拟杆菌菌液（106个/mL），混匀后37℃厌氧培养48 h。按1.6.3项下方法处理后，上机检测。

2　结果与分析

2.116S rDNA测序结果利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装，得到高变区的Tags。这些Tags在97%相似度下聚类为OTU（operational taxonomic units）。与数据库比对后，对OTU进行物种分类，并根据细菌种类的相对丰度（relative abundance）作物种柱状百分比堆积图，着重分析门、属等级的结果表明：体外给予RPD后，拟杆菌门（Bacteroidetes）随给药浓度增加而明显减少，厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）细菌均有不同程度的增加（图1-A）。在属水平的层面，在丰度较高的几种肠道细菌中，拟杆菌属（Bacteroides）、埃希菌属（Escherichia）减少，乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、变形菌属（Proteus）增加。其中，拟杆菌属明显减少（图1-B）。

图1　门（A）、属（B）水平细菌相对丰度图Figure 1 The relative abundance of intestinal flora at phylum（A）and genus（B）level

根据16SrDNA测序结果，本研究挑选被抑制最明显的拟杆菌属细菌，观察大黄牡丹汤对拟杆菌属多样性的改变情况，共检测到5种拟杆菌属细菌。表1结果显示：OTU2、OTU6、OTU31随给药浓度减少，表明大黄牡丹汤对这3种拟杆菌属细菌有抑制作用。而OTU11、OTU26则在一定浓度范围内有所增加。但此结果只能确定到属水平，无法确定具体的细菌种类。

表1　拟杆菌属变化情况Table 1 OTU of Bacteroides in various groups

2.2大黄牡丹汤对肠道菌群短链脂肪酸的影响

2.2.1SCFAs线性范围考察按1.6.2项下方法，以峰面积（μV×min）为纵坐标，乙酸、丙酸、丁酸的浓度（μmol/mL）为横坐标，分别求得乙酸、丙酸、丁酸对照品的线性回归方程、相关系数和线性范围，结果见表2。

表2　SCFAs对照品线性关系考察Table 2　The linear relationship of SCFAs reference

2.2.2精密度试验精密吸取乙酸、丙酸、丁酸对照品50 μL，混合于进样瓶中，加乙醚至1 mL，按1.6.1项下色谱条件连续进样6次。测得乙酸、丙酸、丁酸相对标准偏差（sR）分别为1.42%、2.36%、0.52%。

2.2.3重现性试验取1.6项下空白组样品，按1.6.1项下色谱条件连续进样6次，测得乙酸、丙酸、丁酸sR分别为2.46%、2.76%、2.50%。

2.2.4大黄牡丹汤体外对肠道菌群短链脂肪酸产量的影响表3结果显示：在一定浓度范围内，大黄牡丹汤可体外抑制肠道菌群整体短链脂肪酸的分泌，其中，对丙酸的抑制作用显著（P＜0.01或P＜0.001），对丁酸的影响较缓和，而8 mg/mL大黄牡丹汤对乙酸抑制显著（P＜0.001）。

表3　大黄牡丹汤体外对肠道菌群短链脂肪酸产量的影响Table 3 Effect of DMD on SCFAs secretion of intestinal flora in vitro　（±s，N=3）

表3　大黄牡丹汤体外对肠道菌群短链脂肪酸产量的影响Table 3 Effect of DMD on SCFAs secretion of intestinal flora in vitro　（±s，N=3）

①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，与空白组比较

cSCFAs/（μmol·mL-1）组别　ρ/（mg·mL-1）空白组大黄牡丹汤低剂量组大黄牡丹汤中剂量组大黄牡丹汤高剂量组0248乙酸17.22±1.65 17.44±6.72 14.70±3.94 12.55±1.37③丙酸1.21±0.08 1.10±0.53 0.64±0.32②0.21±0.20③丁酸0.65±0.00 0.64±0.00②0.64±0.00①0.64±0.00②

2.3大黄牡丹汤对脆弱拟杆菌的体外影响

2.3.1平板计数法考察脆弱拟杆菌增殖情况脆弱拟杆菌（B.fragilis）作为拟杆菌属模式菌种，被用于进一步验证大黄牡丹汤对拟杆菌属细菌的影响。图2结果表明：大黄牡丹汤对脆弱拟杆菌的抑制作用呈剂量依赖性（P＜0.001）。

图2　大黄牡丹汤体外对脆弱拟杆菌增殖的影响Figure 2 Effect of DMD on proliferation of Bacteroides fragilis in vitro　（±s，N=3）

2.3.2大黄牡丹汤体外对脆弱拟杆菌短链脂肪酸产量的影响表4结果显示：大黄牡丹汤对脆弱拟杆菌分泌的乙酸、丙酸、丁酸均有显著抑制作用（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。

表4　大黄牡丹汤体外对脆弱拟杆菌短链脂肪酸产量的影响Table 4 Effect of DMD on SCFAs secretion of Bacteroides fragilis in vitro　（±s，N=3）

表4　大黄牡丹汤体外对脆弱拟杆菌短链脂肪酸产量的影响Table 4 Effect of DMD on SCFAs secretion of Bacteroides fragilis in vitro　（±s，N=3）

①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，与空白组比较

cSCFAs/（μmol·mL-1）组别　ρ/（mg·mL-1）空白组大黄牡丹汤低剂量组大黄牡丹汤中剂量组大黄牡丹汤高剂量组0248乙酸8.46±0.89 7.69±0.66 7.43±1.21 6.70±0.29①丙酸1.83±0.13 1.53±0.07①1.50±0.43①1.18±0.03②丁酸0.75±0.02 0.62±0.01③0.58±0.01③0.70±0.03③

3　讨论

肠道菌群是定植在机体肠道中的细菌、古生菌、病毒和一些单细胞真核生物的统称［3］。宏基因组测序显示肠道菌群基因数量是人基因数量的150倍，其中超过99%的基因均来自细菌，且每个个体肠道中所携带的细菌至少超过160种［8］。目前为止，至少有40个菌属约400～500个菌种被认识［9］。近年来，越来越多的研究表明肠道菌群与人体免疫系统、内分泌系统、消化系统等方面的疾病密不可分［10］。

大黄牡丹汤泻热破结、散结消肿，是治疗肠痈的经典方药，但其作用机制尚不完全明确。方中的有效成分主要为总蒽醌、结合蒽醌和丹皮酚［11］，这些成分均具有显著的抗菌消炎作用，与现代医学所认为的“细菌感染是肠痈的主要发病原因之一”相联系，为大黄牡丹汤治疗肠道炎症奠定了物质基础。结合本研究中对整体肠道菌群的研究，发现大黄牡丹汤体外可增加乳杆菌属、乳球菌属、变形菌属，而减少埃希菌属，说明大黄牡丹汤可能通过改变肠道菌群发挥其药效作用。

另外，本研究还发现肠道菌群中的一类条件致病菌——拟杆菌属受到大黄牡丹汤的影响较大。拟杆菌属是一类主要常住于哺乳动物肠道的革兰阴性、无芽孢、专性厌氧的杆菌，也是机体中主要分泌丙酸的细菌。但当机体出现免疫功能紊乱或炎症状态时，拟杆菌属细菌便会成为加重炎症症状、导致内源性感染的条件致病菌［12］。脆弱拟杆菌作为拟杆菌属模式菌种，学界对其研究较多。在人的结肠组织中，脆弱拟杆菌只占正常菌群的不到1%，而在由厌氧菌引起的感染中则占60%～90%［13］。本研究结果表明，大黄牡丹汤可明显抑制拟杆菌属、脆弱拟杆菌，进一步证明肠道菌群可以作为大黄牡丹汤治疗疾病的作用靶点。

除研究大黄牡丹汤对肠道菌群结构的影响外，本研究还初步观察了大黄牡丹汤对肠道菌群代谢产物——短链脂肪酸的影响。短链脂肪酸是肠道厌氧菌酵解未消化的碳水化合物而产生的一类有机酸，其中乙酸、丙酸和丁酸约占短链脂肪酸总量约90%～95%［14］。其中，轻度和中度UC患者粪便中，短链脂肪酸总量较正常组高；而重度UC患者粪便中，短链脂肪酸总量较正常组明显降低［15］。本研究结果显示：大黄牡丹汤可抑制肠道菌群短链脂肪酸的分泌，推测大黄牡丹汤在治疗轻度和中度UC时可能更有优势。研究［16］发现，乙酸、丙酸对炎症因子干扰素γ（IFN-γ）的表达有增强作用，丁酸明显抑制抑炎因子白细胞介素10（IL-10）的表达，推测短链脂肪酸可通过影响细胞因子进而影响炎症。本研究结果显示：大黄牡丹汤可抑制短链脂肪酸的分泌，提示大黄牡丹汤治疗炎症疾病的机制之一可能是通过抑制短链脂肪酸而影响细胞因子的表达，从而缓解炎症症状。

本研究结果表明大黄牡丹汤对肠道菌群结构及其代谢产物有一定影响，表明肠道菌群或其代谢产物可能是中药治疗疾病的作用靶点之一，这不仅可为进一步阐明中药复方作用机制提供研究基础，也可为开发中药新药和疾病治疗新方法提供线索。

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【责任编辑：黄玲】

In-vitro Effect of Dahuang Mudan Decoction on Intestinal Flora

ZHENG Yanyi，WEN Ruyan，LUO Xia，ZHOU Lian
（School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of Dahuang Mudan Decoction（DMD）on structure and function of interstinal flora.Methods 16S rDNA sequencing method，plate counting assay，and gas chromatography（GC）were used to evaluate the effect of DMD on the function of intestinal flora and short-chain fatty acids（SCFAs）secretion in vitro.Results The 16S rDNA sequencing results showed that the relative abundance of Bacteroides and Escherichia was decreased，and that of Lactocacillus，Labtococcus and Proteus was increased.Plate count results showed that the proliferation of Bacteroides fragilis was inhibited by DMD（P＜0.001）.The GC results showed that secretion of short-chain fatty acids of intestinal flora was inhibted by DMD（P＜0.05，P＜0.01 or P＜0.001）.Conclusion Intestinal flora and its metabolites may be the therapeutic target of DMD.

Key words：Dahuang Mudan Decoction/pharmacology；Bacteroides；Bacteroides fragilis；short-chain fatty acids；16S rDNA sequencing；chromatography；gas chromatography

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1007-3213（2016）03 - 0357 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．018

收稿日期：2015-12-07

作者简介：郑彦懿（1991-），女，硕士研究生；E-mail：373866263@qq.com

通讯作者：周联，男，教授，博士研究生导师；E-mail：zl@gzucm.edu.cn

基金项目：广东省自然科学基金资助项目（编号：2015A030313344）；高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（编号：20124425110010）