脉复生对急性血瘀模型大鼠血液流变学及凝血功能的影响

2016-07-07李丽明齐耀群李阿荣李常青郭洁文刘若轩邓志军

广州中医药大学学报 2016年3期

关键词：空白对照血瘀红细胞

李丽明，齐耀群，2，李阿荣，3，李常青，郭洁文，刘若轩，邓志军

（1.广州市中医医院，广东广州　510130；2.广州中医药大学2014级研究生，广东广州　510006；3.广州中医药大学2013级研究生，广东广州　510006；4.广州中医药大学热带医学研究所，广东广州　510405）

脉复生对急性血瘀模型大鼠血液流变学及凝血功能的影响

李丽明1，齐耀群1，2，李阿荣1，3，李常青4，郭洁文1，刘若轩1，邓志军1

（1.广州市中医医院，广东广州510130；2.广州中医药大学2014级研究生，广东广州510006；3.广州中医药大学2013级研究生，广东广州510006；4.广州中医药大学热带医学研究所，广东广州510405）

摘要：【目的】观察脉复生对急性血瘀模型大鼠血液流变学及凝血功能的影响。【方法】选用60只SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组（100 mg/kg阿司匹林）以及脉复生高、中、低剂量组（剂量分别为10、5、2.5 g·kg-1·d-1），连续灌胃给药1周。末次给药后，采用各大鼠注射肾上腺素加冰浴法复制急性血瘀模型，测定各组大鼠血液流变学、凝血功能、红细胞压积和沉降率、血小板和红细胞电泳时间、血小板聚集率；采用酶联免疫吸附法测定血浆P选择素、血栓调节蛋白含量。【结果】与空白对照组比较，模型对照组大鼠的凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）均显著缩短（P<0.01），而血浆P选择素、血栓调节蛋白、纤维蛋白原（FIB）的含量均显著增加（P<0.05或P<0.01）；与模型对照组比较，脉复生组可显著降低血液流变参数，延长凝血酶时间、凝血活酶时间和凝血酶原时间，降低纤维蛋白原含量、血浆P选择素、血栓调节蛋白（P<0.05或P<0.01）；与空白对照组比较，模型对照组血小板和红细胞电泳时间显著缩短（P< 0.05或P<0.01），脉复生组可延长血小板和红细胞的电泳时间（P<0.05或P<0.01）。【结论】脉复生通过介导血浆P选择素和血栓调节蛋白而改善急性血瘀大鼠的血液流变性和凝血功能。

关键词：脉复生；急性血瘀模型大鼠；血液流变性；凝血功能；血浆P选择素；血栓调节蛋白；FIB；PT；APTT；TT

Results Compared with the blank group，prothrombin time（PT），activated partial thromboplastin time（APTT），and thrombin time（TT）of the model group were shortened（P<0.01），and the contents of plasma P-selectin，thrombomodulin and fibrinogen（FIB）were enhanced（P<0.05 or P<0.01）.Compared with the model group，blood hemorheology indexes were reduced，PT，APTT，and TT were prolonged，and plasma P -selectin，thrombomodulin and FIB of Maifusheng groups were decreased（P<0.05 or P<0.01）.Platelet and erythrocyteelectrophoresis time was shortened in the model group（P＜0.05 or P＜0.01 compared with that in the blank group），and then was prolonged after treated with Maifusheng（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Maifusheng can improve hemorheology and blood coagulation function of acute blood stasis rats through regulating P-selectin and thrombomodulin expression.

plasma p-selectin；thrombomodulin；FIB；PT；APTT；TT

脉复生是广州市中医医院研制并用于治疗血栓闭塞性脉管炎（TAO）的特色中药制剂，前期研究证实其能对抗血小板聚集和血栓的形成、抑制动脉血管内皮细胞的凋亡和羟脯氨酸与糖胺多糖的合成［1-2］。本研究通过大鼠腹腔注射去甲肾上腺素结合冰水浴的方法建立急性血瘀模型，研究脉复生对急性血瘀证大鼠血液流变性及凝血功能的改善作用，为深入阐明脉复生的药效物质基础及治疗作用机制、提高用药的安全性提供科学依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量220～250 g，购于广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证号：SCXK（粤）2013-0002，实验前在实验环境下适应性饲喂1周。

1.2主要试剂与药物脉复生合剂为广州市中医医院院内制剂，由牛大力30 g、熟地黄20 g、白花蛇舌草20 g等药物组成；盐酸肾上腺素注射液购于福州海王福药制药有限公司（批号：20140718）；阿司匹林肠溶片购于山东新华制药股份有限公司（批号：20131122）；凝血酶原时间（PT，批号：20140507）、活化部分凝血活酶时间（APTT，批号：20140613）、凝血酶时间（TT，批号：20140422）、纤维蛋白原（FIB，批号：20141002）检测试剂盒均购于南京建成生物科技有限公司；大鼠血浆P选择素酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（批号：CSB-E17287r）、大鼠血栓调节蛋白ELISA试剂盒（批号：CSB-E17291r）购于武汉华美生物工程有限公司；其他所用试剂均为AR级分析纯。

1.3实验仪器EHK-40红细胞沉降压积仪（天津市亚坤电子科技发展有限公司）；F13168红细胞变形聚集仪（北京飞斯富睿科技有限公司）；DMNNX-B型血小板聚集凝血因子分析仪（北京中科富邦医疗设备有限公司）；HF-3000血常规检测仪（山东海力孚企业管理有限公司）；LG-R-80A全自动血液分析仪（北京中科富邦医疗设备有限公司）；LBYN6C全自动血液黏度仪（北京普利生仪器有限公司）；MVIS 2030全自动血流变分析仪（重庆天海科技有限公司）；SD34XN200细胞电泳仪（北京中西化玻仪器科技公司）；ELITIST 21K-R高速冷冻离心机（北京吉尔森科技有限公司）；多功能酶标仪（Perkin Elmer USA）。

1.4脉复生制备及动物分组和给药按组方的配置，水煎1 h，过滤，再煎1次，合并续滤液，水浴浓缩，得到生药浓度1 g/mL。SD大鼠60只，随机分为空白对照组（10 mL/kg生理盐水）、模型对照组（10 mL/kg生理盐水）、阳性对照组（100 mg/kg阿司匹林）、脉复生高剂量组（剂量为10 g/kg）、脉复生中剂量组（剂量为5 g/kg）、脉复生低剂量组（剂量为2.5 g /kg），每组10只。口服灌胃给药，连续给药1周，每日给药早晚各1次。

1.5大鼠急性血瘀证模型复制［2］皮下注射盐酸肾上腺素注射液（0.8 mg/kg）2次，间隔4 h。首次注射2 h后，将大鼠置于0℃冰水浴5 min，复制急性血瘀模型，再次注射后禁食不禁水饲养。

1.6血小板聚集率、血浆P选择素、大鼠血栓调节蛋白测定造模12 h后，腹腔注射100 mg/L的水合氯醛，待大鼠全麻后，打开腹腔，分离肠系膜，腹主动脉取血2 mL，用枸橼酸钠抗凝，在1 000 r/min下离心5 min，沉淀得富血小板血浆；再3 500 r/min下离心5 min，沉淀得贫血小板血浆，获得血小板浓度为3.2×107/mL，用血小板凝聚诱导剂ADP（5 μmol/L），使用比浊法在37℃条件下测定1 min、5 min血小板聚集率以及5 min内血小板最大（Max）聚集率，计算血小板聚集抑制率（%）。血小板聚集抑制率=（模型组聚集率-用药组聚集率）/模型组聚集率×100%。另取枸橼酸钠抗凝血1 mL，3 500 r/min离心15 min，吸取上层血浆，采用ELISA法测定血浆P选择素和大鼠血栓调节蛋白。

1.7血液流变学、凝血功能、红细胞沉降率、红细胞压积测定造模12 h后，腹腔注射100 mg/L的水合氯醛，待大鼠全麻后，打开腹腔，分离肠系膜，从腹主动脉取血，测APTT、TT、PT、全血黏度（WBV）、血浆黏度（PV）、纤维蛋白原（FIB）、红细胞电泳时间、血小板电泳时间等血液流变学和凝血功能相关指标；以肝素钠抗凝，取1.5 mL全血静置于压积管1h，记录红细胞沉降率，12 000 r/min离心10 min，记录红细胞压积。

1.8血小板和红细胞电泳时间测定造模12 h后，腹腔注射100 mg/L的水合氯醛，待大鼠全麻后，打开腹腔，分离肠系膜；从腹主动脉取血，肝素钠抗凝；将抗凝血制成血浆红细胞悬液，红细胞数约为106～107/L，用琼脂盐桥（15 g/L琼脂，100 g/L生理盐水）与电极连接，采用40 V的直流电源，观察单个红细胞在网格测微型视野下连续往返跳动2格的时间为红细胞电泳时间，自动记录每个样本500个数据的平均值。血小板电泳时，电压为35 V，采用银丝琼脂电极，显微镜放大400倍，观察血小板在血浆中往返2格的时间，每个样本平均观察10个样本，取均值，记录。

1.9统计方法采用SPSS 17.0软件进行统计分析，方差齐用t检验，方差不齐用t’检验，数据以均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组对急性血瘀大鼠APTT、TT、PT的影响表1结果显示：与空白对照组比较，模型对照组APTT、TT、PT显著缩短（P＜0.01），提示造模成功；与模型对照组比较，脉复生高、中剂量组能显著延长大鼠的APTT、TT、PT（P＜0.05或P＜0.01）。

表1　各组对急性血瘀大鼠APTT、TT、PT的影响Table 1 Effect of Maifusheng on APTT，TT and PT of acute blood stasis model rats　（±s，t/s）

①P＜0.01，与空白对照组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型对照组比较

组别空白对照组模型对照组阳性对照组脉复生低剂量组脉复生中剂量组脉复生高剂量组N 10 10 10 10 10 10 APTT 24.25±4.36 14.49±3.72①22.89±7.39 15.72±5.37 17.64±4.02②20.01±3.97③PT 19.65±4.07 13.39±3.71①17.59±3.25 14.05±3.19 14.92±3.51②16.74±3.23②TT 35.88±5.47 24.87±4.38①30.52±4.98 25.31±4.03 26.23±3.65②28.75±3.86③

2.2各组对急性血瘀大鼠全血黏度和血浆黏度的影响表2结果显示：与空白对照组比较，模型对照组大鼠的全血切变率在在200、50、5 s-1下的全血黏度及血浆黏度显著增高（P＜0.05）；与模型对照组比较，脉复生高、中剂量组可显著降低各切变率下的全血黏度（P＜0.05），脉复生高剂量组可降低血浆黏度（P＜0.05）。

2.3各组对急性血瘀大鼠纤维蛋白原含量和红细胞压积及沉降率的影响表3结果显示：与空白对照组比较，模型对照组大鼠的纤维蛋白原含量、红细胞压积及红细胞沉降率显著增加（P＜0.05或P＜0.01）；与模型对照组比较，脉复生高、中剂量组可显著降低纤维蛋白原含量、红细胞压积及红细胞沉降率（P＜0.05或P＜0.01）。

2.4各组对急性血瘀大鼠血小板聚集率的影响

表4结果显示：与空白对照组比较，模型对照组大鼠的血小板聚集率显著升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，脉复生低、中、高剂量组均可显著降低血小板聚集率（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各组对急性血瘀大鼠WBV和PV的影响Table 2 Effect of Maifusheng on WBV and PV of acute blood stasis model rats　（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，与空白对照组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与模型对照组比较

组别　N　ηWBC/（mPa·s）　ηPV/（mPa·s）空白对照组模型对照组阳性对照组脉复生低剂量组脉复生中剂量组脉复生高剂量组10 10 10 10 10 10 5 s-118.25±3.34 30.35±4.96②23.22±3.21 27.95±3.93 25.46±4.26③23.97±4.15④50 s-16.23±1.14 9.77±1.32②5.36±1.25 8.80±1.08 6.15±1.37③5.97±1.41④200 s-13.21±0.43 4.84±0.75①3.81±0.62 4.47±0.67 4.25±0.79③4.03±0.72③1.32±0.39 1.79±0.471①1.41±0.51 1.81±0.42 1.73±0.25 1.55±0.3③

表3　各组对急性血瘀大鼠血浆纤维蛋白原和红细胞压积及沉降率的影响Table 3 Effects of Maifusheng on FIB，hematocrit and erythrocyte sedimentation rate of acute blood stasis model rats　（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，与空白对照组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与模型对照组比较

组别空白对照组模型对照组阳性对照组脉复生低剂量组脉复生中剂量组脉复生高剂量组N 10 10 10 10 10 10 p纤维蛋白原/（g·L-1）2.73±0.26 7.45±0.92②4.63±0.51 7.29±0.73 5.96±0.92③5.02±0.75④V红细胞沉降率/（mm·h-1）50.31±8.23 62.42±7.62①55.37±9.31 61.29±8.95 58.42±6.27③52.83±7.33④p红细胞压积/% 0.41±0.09 0.87±0.13②0.46±0.07 0.79±0.11③0.67±0.08④0.50±0.17④

表4　各组对急性血瘀大鼠血小板聚集率的影响Table 4 Effect of Maifusheng on platelet aggregation rate of acute blood stasis model rats　（±s）

①P＜0.01，与空白对照组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型对照组比较

组别　N　p血小板聚集率/%　p凝聚抑制率/%空白对照组模型对照组阳性对照组脉复生低剂量组脉复生中剂量组脉复生高剂量组10 10 10 10 10 10 1 min 18.82±3.63 35.24±7.81①23.73±3.19 31.49±5.21②27.46±4.96③24.21±4.32③5 min 18.64±3.14 37.54±6.31①6.32±3.36 35.90±5.72②26.92±5.25③24.63±4.91③Max 19.32±3.27 39.61±7.87①28.41±4.44 37.23±4.94②28.31±3.52③26.24±4.38③——28.27 6.01 28.53 33.75

2.5各组对急性血瘀模型大鼠红细胞和血小板电泳时间的影响表5结果显示：与空白对照组比较，模型对照组大鼠的红细胞电泳时间、血小板电泳时间显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。与模型对照组比较，脉复生中、高剂量组可显著降低红细胞电泳时间、血小板电泳时间（P＜0.05或P＜0.01）。

表5　各组对急性血瘀大鼠红细胞和血小板电泳时间的影响Table 5　Effect of Maifusheng on platelet and erythrocyte electrophoresis time of acute blood stasis model rats　（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，与空白对照组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与模型对照组比较

组别空白对照组模型对照组阳性对照组脉复生低剂量组脉复生中剂量组脉复生高剂量组N 10 10 10 10 10 10 t红细胞电泳/s 16.21±3.55 28.49±6.14②17.27±3.43 23.28±4.33 20.36±4.25③16.84±4.11④t血小板电泳/s 23.75±5.12 35.59±5.87①25.29±6.33 30.13±5.44 28.89±6.12③24.46±5.47③

2.6各组对急性血瘀大鼠血浆P选择素和血栓调节蛋白的调节作用表6结果显示：模型对照组大鼠的血浆P选择素和血栓调节蛋白的含量显著高于空白对照组（P＜0.01）；脉复生中、高剂量组血浆P选择素和血栓调节蛋白含量较模型对照组显著下降（P＜0.05或P＜0.01），且呈明显的剂量依赖性，提示脉复生可通过介导血浆P选择素和血栓调节蛋白改善急性血瘀大鼠血液流变性及凝血功能。

表6　各组大鼠血浆P选择素和血栓调节蛋白的含量比较Table 6 Comparison of P-selectin and thrombomodulin contents in various groups　（±s）

①P＜0.01，与空白对照组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型对照组比较

组别空白对照组模型对照组阳性对照组脉复生低剂量组脉复生中剂量组脉复生高剂量组N 10 10 10 10 10 10ρ血浆P选择素/（μg·L-1）14.54±2.17 26.26±4.61①15.23±3.41 20.63±3.24 18.82±3.45②16.39±2.86③ρ血栓调节蛋白/（μg·L-1）7.42±2.07 12.25±3.71①10.85±2.64 12.25±3.28 11.28±2.65②9.55±1.86②

3　讨论

经过40余年的临床实践，脉复生已证实具有行气滋肾、养血活血、止痛散结等作用，对血栓性闭塞性脉管炎、动脉硬化闭塞症及糖尿病足具有较好的治疗效果［3-4］。研究［5］证实脉复生能较好地对抗二磷酸腺苷（ADP）诱导的血小板聚集作用，能非常显著地缩短纤维蛋白溶解时间而不影响凝血时间，并能明显地对抗实验性血栓。患有脉管炎等血管性疾病的患者，在应激状态下容易造成机体处于高凝状态，最后形成血栓。因此，本研究选用了急性血瘀模型，该模型可以在短时间内评价脉复生能否较好地对抗ADP诱导的血小板聚集和对抗大鼠实验性血栓的形成。

血栓闭塞的主要诱因是血管内皮细胞坏死脱落、红细胞破裂或血小板的沉积、高血脂患者体内胆固醇在血管内壁的沉积，最终导致血管腔狭窄，血管韧性降低，从而引起血管栓塞［6］。纤维蛋白是血栓闭塞形成的骨架物质，研究［7-8］也证实血液流变性及凝血功能的异常是急性血瘀症的重要病理表现，其主要影响因素是纤维蛋白升高引起分子间牵连增大了血液黏度，而桥联作用又进一步增高红细胞的聚集性，加重血液黏度。APTT、PT和TT是检测内、外源性凝血和凝血共同通路变化的主要筛选指标，其中TT与纤维蛋白呈负相关，TT缩短纤维蛋白含量相应升高［9］。本研究结果提示脉复生通过降低血浆黏度、减少红细胞聚集以及红细胞压积，减少血小板聚集，从而降低大鼠的全血黏度；促进纤维蛋白的溶解，延长活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间和凝血酶时间。

血浆P选择素是血小板或内皮细胞活化释放产物之一，在血栓形成过程中起着扳机点的作用，血小板活化时被释放于血浆中，介导活化血小板和内皮细胞、白细胞和内皮细胞之间的黏附，是血小板活化释放的特异标志之一，可以作为血栓前状态及血栓形成的标志性中间产物［10］；而血栓调节蛋白是一种广泛分布于各种组织血管内皮细胞膜的单链糖蛋白，具有抗凝、抑制凝血酶、促进抗凝血酶灭活凝血酶等作用，作为凝血调节剂，它的存在不仅对凝血机制有重要的调节作用，还能降解纤溶酶原激活物抑制剂，增加血液中纤溶酶原激活物水平，促进纤维蛋白溶解［11-12］。本研究结果显示：脉复生能降低血浆P选择素和血栓调节蛋白含量，且呈一定的剂量依懒性，提示脉复生通过介导血浆P选择素和血栓调节蛋白改善急性血瘀大鼠血液流变性及凝血功能。下一步将从其改善血液流变性及凝血功能的分子机制方面作深入研究，为阐明脉复生的药效物质基础及治疗作用机制、提高用药的安全性提供科学依据。

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【责任编辑：黄玲】

Effect of Maifusheng on Hemorheology and Blood Coagulation Function of Acute Blood Stasis Model Rats

LI Liming1，QI Yaoqun1，2，LI Arong1，3，LI Changqing4，GUO Jiewen1，LIU Ruoxuan1，DENG Zhijun1
（1.Guangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510130 Guangdong，China；
2.Graduate Candidate in 2014，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；
3.Graduate Candidate in 2013，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；
4.Institute of Tropical Medicine，Guangzhou University of Chinese Mdeicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

Key words：Maifusheng；acute blood stasis model rats；hemorheology；blood coagulation function；

Abstract：Objective To study the effect of Chinese herbal medicine preparation Maifusheng on hemorheology and blood coagulation function of acute blood stasis model rats.Methods Sixty SD rats were randomly divided into blank group，model group，positive control group（100 mg/kg of asprine），and high-，middle- and low-dose Maifusheng groups（in the dosage of 10，5，2.5 g·kg-1·d-1，respectively）.Intragastric administration lasted for one week.After the last medication，acute blood stasis model was induced by injection of epinephrine plus ice bath.Hemorheology，blood coagulation function，platelet and erythrocyte electrophoresis time，and parameters of hemorheology and platelet in various groups were determined.Enzyme -linked immunosorbent assay（ELISA）was used for the detection of plasma P-selectin and thrombomodulin contents.

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1007-3213（2016）03 - 0353 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．017

收稿日期：2015-10-19

作者简介：李丽明（1975-），女，副主任中药师；E-mail：ggchan911@163.com

通讯作者：郭洁文（1968-），女，主任药师，博士研究生导师；E-mail：guo774@sina.com

基金项目：广东省中医管理药局基金项目（编号：20151065、20141227）；广州市中医药和中西医结合科技项目（编号：20152A011011、20142A011012）