琼脂糖珠富集β-actin蛋白实验条件的优化

袁明美，姜　泓，冯雪松*

(1.中国医科大学 药学院，辽宁 沈阳 110122；　2.中国医科大学 公共卫生学院,辽宁 沈阳 110122)



琼脂糖珠富集β-actin蛋白实验条件的优化

袁明美1，姜泓2，冯雪松1*

(1.中国医科大学 药学院，辽宁 沈阳 110122；2.中国医科大学 公共卫生学院,辽宁 沈阳 110122)

摘要：研究不同反应条件(样品初始浓度、温度、时间)下，protein A+G agarose对小鼠脑组织中β-actin蛋白富集的影响．结果在样品初始浓度为0.5 g/L，4 ℃条件下偶联反应2 h，Protein A+G agarose对小鼠脑组织中β-actin蛋白的富集效果最好、并且稳定性与重现性良好．

关键词：琼脂糖珠；β-actin蛋白；条件优化；蛋白富集

蛋白质是生命形态中最重要的分子，对其结构、功能及含量进行研究时，常需将目的蛋白从组织或细胞等复杂生物体系中分离、纯化出来[1]．琼脂糖珠作为载体介质在蛋白质的纯化过程中起着重要的作用，其原理是以免疫沉淀(IP)技术的抗体与抗原间的特异性结合为基础[2]，将“靶蛋白-抗靶蛋白抗体-protein A或/和G agarose”的复合物从混合生物体系中沉淀、分离出来[3-4]，经变性后，通过与聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术结合，对靶蛋白的分子量等特性进行定性或定量研究[5]．但是“靶蛋白-抗靶蛋白抗体”与agarose偶联的过程受到多种因素的影响，如样品初始浓度、偶联温度和时间等[6]．本研究以protein A+G agarose对小鼠脑匀浆液中β-actin的富集为例，初步探讨样品初始浓度、偶联温度及时间对protein A+G agarose与“β-actin抗原-抗体结合物”偶联过程的影响．对于开发基于琼脂糖珠的免疫沉淀技术用于蛋白检测、纯化以及蛋白-蛋白相互作用等研究有一定的参考价值和指导意义．

1实验部分

1.1仪器与试剂

全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)；全波长扫描酶标仪(Bio Tek仪器公司)；电泳仪(上海天能科技有限公司)；四维旋转混匀器(海门市其林贝尔仪器有限公司)；超级恒温混匀仪(杭州奥盛仪器有限公司)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；XW-80A旋涡混合器(上海精科实业有限公司)；3K-18超速冷冻离心机(Sigma公司)；干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)；protein A+G agarose珠(日本Beyotime公司)；鼠抗β-actin单克隆抗体(Proteintech公司)；BCA蛋白定量测定试剂盒、细胞裂解液RIPA、胰蛋白酶抑制剂PMSF、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；ECL化学发光检测试剂盒(Buckinghamsire公司)；其他试剂均为市售优级纯或分析纯试剂．

1.2总蛋白样品的制备

精密称取小鼠脑组织适量，每100 mg脑组织中加入1 mL RIPA和PMSF的混合液(100∶1，体积比)，冰浴下超声匀浆6 min，然后冰浴下裂解2 h，4 ℃离心(12 000 r·min-1)20 min，吸取上清液，备用．

1.3脑组织中β-actin的提取及纯化

取“1.2”项下浓度为0.5 g/L的上清液1 mL，加入10 μL浓度为1 g/L的β-actin抗体，4 ℃下摇动(750 r·min-1)30 min，使之充分偶联结合，加入protein A+G agarose 100 μL，4 ℃下摇动(750 r·min-1)2 h，然后离心(2 500 r·min-1)5 min，分别得到上清液和“β-actin-抗β-actin抗体-protein A+G agarose”偶联复合物，备用．

1.4β-actin蛋白的洗脱

取“1.3”项下的偶联复合物，加入1 mL结合洗涤液，混匀，离心(2 500 r·min-1)5 min，弃去上层清液，重复3次．然后加入100 μL 1×SDS蛋白电泳上样缓冲液，重悬偶联复合物，100 ℃加热5 min，放置室温，离心(2 500 r·min-1)5 min，取上清液，备用．

1.5不同提纯条件对β-actin蛋白提取量的影响

1.5.1样品初始浓度的影响

将“1.2”项下的样品溶液稀释成浓度为0.1、0.2、0.5、1和2 g/L的样品溶液，平行做2份，按“1.3”和“1.4”项下方法操作．

1.5.2温度的影响

取“1.2”项下浓度为0.5 g/L的样品溶液，在4 ℃和25 ℃条件下，按“1.3”和“1.4”项下方法操作．

1.5.3吸附时间的影响

取“1.2”项下浓度为0.5 g/L的样品溶液，protein A+G agarose与“β-actin-抗β-actin抗体”分别结合0.5 、1 、2 、4 和12 h．再按“1.3”和1.4“项下方法操作．

1.6β-actin含量测定

1.6.1Western blot测定β-actin的含量

取1.5项下上清液10 μL，进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，4 ℃过夜孵育一抗β-actin抗体(1∶8 000)．洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000)，室温轻摇2 h，充分洗膜后，化学发光，胶片曝光显影，扫描灰度值[7]．

1.6.2BCA法测定β-actin的含量

采用BCA试剂盒，按照试剂盒的方法测定protein A+G agarose吸附前后脑组织匀浆液中蛋白含量．protein A+G agarose吸附β-actin的量按下式计算[8]:

式中:Q：protein A+G agarose吸附量(g/g)；m为protein A+G agarose的质量(mg)；C0、C1分别为吸附前和吸附后蛋白浓度(g/L)；V0、V1分别为吸附前和吸附后的体积(mL)．

2结果与讨论

2.1样品初始浓度对β-actin蛋白提取量的影响

图1为样品初始浓度对β-actin蛋白提取量的影响．图1(a)和(b)为western blot的实验结果，由图1(b)可见，Western blot检测β-actin蛋白灰度值分析结果表明，当浓度小于0.5 g/L时，β-actin吸附量随样品浓度的增加而增多，变化趋势比较明显；当浓度大于0.5 g/L时，随浓度增加而增多的趋势渐趋平缓，说明protein A+G agarose偶联β-actin蛋白的量达到饱和，这可能与protein A+G agarose比表面积的限制有关．同时，通过图1(a)Western blot条带的深浅也可直观的证明这一点．图1(c)为BCA法检测β-actin蛋白含量的结果，变化趋势与Western blot含量测定结果一致．结果表明在样品浓度达到0.5 g/L时，protein A+G agarose偶联β-actin蛋白的量达到饱和．

2.2偶联温度对β-actin蛋白提取量的影响

图2是偶联温度对protein A+G agarose偶联β-actin蛋白量的影响．图2(a)和(b)为western blot的实验结果，由图2(b)可知，在4 ℃条件下，protein A+G agarose提取得到的β-actin蛋白的灰度值比25 ℃时高，并且图2(a)的Western blot条带的深浅也可直观的证明这一点．图2(c)为BCA法检测β-actin蛋白含量的结果，变化趋势与Western blot含量测定结果一致．结果表明，4 ℃条件下，有益于protein A+G agarose提取到更多的β-actin蛋白．

此外，我们的实验还考察了在37 ℃条件下，protein A+G agarose对β-actin蛋白的提取情况(结果未列入本文)，结果发现随温度升高，protein A+G agarose对β-actin蛋白的提取量逐渐降低，以4 ℃条件下提取效果最好．其主要原因与生物样品中存在着能降解蛋白质的酶有关．在温度较高时，酶的活性不易被酶抑制剂所抑制，进而导致蛋白降解，出现偶联蛋白量减少的情况．在较高温度下，即使分子的布朗运动增加，加大了protein A+G agarose与β-actin蛋白碰撞的机会而增加吸附偶联量，也无法抵消整体蛋白量降低所导致的吸附偶联量降低．4 ℃反应条件下，酶的活性可以较好的被抑制，同时四维旋转混悬(750 rpm/min)孵育并不会降低protein A+G agarose与β-actin蛋白接触的机会，结果表明有较好的吸附偶联效果．

(a)western blot图片

(b)western blot灰度值

(c)BCA法测定的蛋白量图1　样品初始浓度对β-actin蛋白提取量的影响Fig.1　Effect of the initial sample concentration on the amount of β-actin protein extraction

2.3偶联时间对β-actin蛋白提取量的影响

图3是偶联时间对protein A+G agarose偶联吸附β-actin蛋白量的影响．图3(a)和(b)为western blot的实验结果，结果表明，protein A+G agarose与β-actin蛋白在4 ℃条件下反应2 h，提取β-actin蛋白的量达到峰值，但随着时间延长提取量逐渐降低．并且图3(a)的Western blot条带的深浅也可直观的证明这一点．图3(c)为BCA法检测β-actin蛋白含量的结果，变化趋势与Western blot含量测定结果一致．其主要原因是，agarose是细菌蛋白质的“protein A/G”的载体，而且尺寸很小，其对蛋白的吸附偶联主要发生在外表面，利用“protein A/G”特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的Fc片段，不存在内扩散现象，故不存在太大的时间依赖性．相反，时间越长生物样品中蛋白降解越严重，从而使吸附偶联效率降低．

(a)western blot图片

(b)western blot灰度值

(c)BCA法测定的蛋白量图2　反应温度对吸附总蛋白量和β-actin蛋白的影响Fig.2　Effect of reaction temperature on the amount of β-actin protein extraction

2.4重复验证实验结果

在优化的样品初始浓度、偶联温度和时间下，使用初始浓度为0.5 g/L的样品，protein A+G agarose与“β-actin-抗β-actin抗体”复合物在4 ℃条件下偶联反应2 h，平行做3份样品．由表1可知，灰度值与蛋白含量结果的RSD≤ 8.08%．说明在优化的条件下，可以保证使用protein A+G agarose富集β-actin蛋白具有良好的稳定性和重现性．

(a)western blot图片

(b)western blot灰度值

(c)BCA法测定的蛋白量图3　反应时间对吸附总蛋白量和β-actin蛋白的影响Fig.3　Effect of reaction time on the amount of β-actin protein extraction

123均值RSD/%灰度值529.726516.531574.788540.3485.65蛋白量(g/L)2.4832.1622.5072.3848.08

3结论

在4 ℃反应2 h条件下，琼脂糖珠对蛋白有较好的富集作用，建立的protein A+G agarose富集β-actin蛋白的方法具有良好的稳定性和重现性．

参考文献：

[1] 陆健等. 蛋白质纯化技术及应用[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005： 1-2.

[2] GRONENBORN A M， CLORE G M. Identification of the contact surface of a streptococcal protein G domain complexed with a human Fc fragment [J]. Mol Biol, 1993， 233(3)： 331-335.

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[责任编辑：任铁钢]

收稿日期：2015-12-15.

基金项目：国家自然科学基金项目(81473417).

作者简介：袁明美(1991-)，女，硕士生，主要从事化学生物分析及作用机制研究.*通讯联系人，Email：voncedar@126.com.

中图分类号：R286.02

文献标志码：A

文章编号：1008-1011(2016)03-0345-04

Optimization of experimental conditions on agarose beads enrichingβ-actin protein

YUAN Mingmei1，JIANG Hong2，FENG Xuesong1*

(1.Collegeofpharmacy,ChinaMedicalUniversity，Shenyang110122，Liaoning，China；2.CollegeofPublicHealth，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110122，Liaoning，China)

Abstract:The effects of different reaction conditions (initial sample concentration, temperature and time) on the amount of mice brain β-actin enriched by protein A + G agarose were studied． Results showed that 0.5 mg/mL of the initial concentration, and reaction of 2 h at 4 ℃ were the optimal experimental conditions. Protein A + G agarose could enrich the most β-actin in mice brain．The methods showed good stability and reproducibility．

Keywords:agarose beads；β-actin protein；optimization conditions；protein enrichment