白细胞介素-33对急性冠脉综合征患者的免疫调节作用及其机制*

熊晓昉，　黄春燕，　李　俊，　蒋　雯

武汉市第三医院心内科，武汉　430060

白细胞介素-33对急性冠脉综合征患者的免疫调节作用及其机制*

熊晓昉，黄春燕，李俊，蒋雯△

武汉市第三医院心内科，武汉430060

摘要：目的探讨白细胞介素-33(interleukin-33，IL-33)对急性冠脉综合征患者的免疫调节作用及可能机制。方法选取137例在武汉市第三医院心内科行冠状动脉造影患者作为研究对象，并依病情将其分为对照组、稳定性心绞痛组和急性冠脉综合征组。分选患者的外周血单个核细胞并平均分为2份，分别与或不与IL-33共培养。培养3 d后，运用流式细胞术检测各组患者外周血中Th1、Th2、Th17及Treg细胞的比例；通过检测3[H]-胸腺嘧啶核苷的摄入评估Treg细胞的增殖能力；采用RT-PCR检测Foxp3 mRNA的表达。结果①与对照组和稳定性心绞痛组相比，急性冠脉综合征组患者体内Treg细胞数目明显减少并且其抑制效应性T淋巴细胞增殖的功能严重受损，Th1和Th17细胞过度增殖。②与未经IL-33处理组相比，经IL-33处理后Treg细胞的数量明显增加，Treg细胞比例及功能得以恢复，Th2细胞的比例上调。结论IL-33可能通过上调Th2和修复Treg细胞有效调节急性冠脉综合征患者体内免疫失衡。

关键词：急性冠脉综合征；白细胞介素-33；免疫调节

急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是严重威胁人类生命健康的心血管疾病，同时给患者家庭和社会带来了沉重的经济负担。因此对ACS发病机制及有效干预手段的探寻成为众多研究者关注的热点。尽管目前对于ACS的具体机制还不是非常明确，但是越来越多的研究结果证实CD4+T细胞在其病理生理过程中发挥着重要作用。CD4+T细胞主要由辅助性T细胞1(Th1)、Th2、Th17及Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)组成。目前研究发现作为维持免疫稳态的Treg在ACS患者外周血中数量明显减少，从而无法有效抑制Th1及Th17细胞的过度增殖[1]。而高度增殖的Th1及Th17可通过分泌众多的炎症性细胞因子来破坏ACS患者粥样斑块的稳定性，导致ACS症状的发生[2-3]。

白细胞介素-33(Interleukin-33，IL-33)作为IL-1家族最新发现的一个成员，其通过与特异性受体ST2结合后，活化下游的信号通路，从而发挥调节免疫应答的作用。最近Miller等[4]研究发现，通过给ApoE-/-小鼠注射外源性的IL-33，可以促进Th1向Th2转化，从而有效地延缓了粥样斑块的进展。然而IL-33对ACS患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的作用尚未见文献报道。因此，我们通过分析ACS患者IL-33处理组与未处理组PBMC细胞数量及功能的变化，以期进一步探讨IL-33对ACS患者免疫反应的调节作用及潜在的机制。

1资料与方法

1.1研究对象

选取在武汉市第三医院行冠状动脉造影检查的137例患者作为研究对象，并将其分为3组：①对照组(Control)，男32例、女14例，平均年龄(58±4)岁，患者有胸痛但不伴心电图异常及冠状动脉狭窄；②稳定性心绞痛组(SA)，男28例、女12例，平均年龄(57±5)岁，有持续3个月以上的性质和严重程度恒定的劳力性心绞痛，同时冠脉造影显示冠状动脉有严重狭窄(≥75%)；③急性冠脉综合征组(ACS)，男35例，女16例，平均年龄(56±5)岁，有不稳定心绞痛或急性心肌梗死。不稳定心绞痛：存在静息性心绞痛同时伴随有短暂的心肌缺血的心电图改变[ST段压低和(或)T波倒置]，但血清心肌梗死标记物无明显升高。急性心肌梗死：检测到明显升高的血清心肌坏死标记物，同时伴有持续严重的胸骨后疼痛。

研究对象排除标准包括：近期服用过抗炎药物；合并有房颤、风湿性心脏病、瓣膜性心脏病、免疫性疾病、恶性肿瘤、严重的肝脏疾病、严重肾功能衰竭、栓塞、结缔组织疾病等患者。

1.2方法

1.2.1标本采集及人PBMC分离于患者入院的第2日清晨，用肝素钠抗凝管采取空腹静脉血10 mL(采血在症状发作24 h内)。通过Ficoll梯度离心法获得人PBMC。

1.2.2细胞培养取Control组(n=36)、SA组(n=30)及ACS组(n=41)部分患者获得的PBMC，用完全培养液[RPMI-1640培养液中加入100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，2 mmol/L谷氨酰胺和10%热灭活的胎牛血清(Gibco公司)]重悬后平均分成2份。将每份细胞以2×106/mL的密度种于24孔板中。其中一份的所有细胞加入IL-33(1 ng/mL，Biolegend公司)、anti-CD3抗体(3 μg/mL，eBioscience公司)和anti-CD28抗体(1 μg/mL，eBioscience公司)后在37℃、5% CO2的培养箱中培养3 d；另外的一份细胞则加入anti-CD3抗体(3 μg/mL，eBioscience公司)和anti-CD28抗体(1 μg/mL，eBioscience公司)后在37℃、5% CO2的培养箱中孵育3 d。培养3 d后收集各组细胞，用PBS缓冲液洗涤后均分为2份用于检测Treg和Th细胞表达。

1.2.3流式细胞术检测Treg细胞百分比将收集的PBMC用PBS缓冲液洗涤2次后，加入anti-humanCD4-FITC抗体(eBioscience公司)和anti-human CD25-APC抗体(eBioscience公司)并在4℃避光孵育30 min；细胞膜标记染色完成后，将细胞用PBS缓冲液洗涤2次并用固定、破膜试剂4℃孵育30 min。最后加入anti-human Foxp3-PECy5抗体4℃孵育30 min，PBS缓冲液洗涤2次，重悬后上流式细胞仪检测。

1.2.4流式细胞术检测Th细胞百分比将收集的PBMC用PBS缓冲液调整密度为1×106/mL后种于24孔板，并在每孔细胞中加入刺激剂佛波酯(PMA，50 ng/mL，Sigma公司)、离子霉素(1 μmol/L，Sigma公司)和莫能霉素(500 ng/mL，eBioscience公司)，在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养4 h。培养结束后，PBS缓冲液洗涤细胞2次，然后加入anti-human CD4-FITC抗体(eBioscience公司)在4℃孵育30 min。PBS缓冲液洗涤2次并固定、破膜后，将细胞分至3个测定管中，分别加入anti-human INF-γ-PE、anti-human IL-4-PE和anti-human IL-17-PE(eBioscience公司)，4℃避光孵育30 min；PBS缓冲液洗涤2次后重悬上流式细胞仪检测。

1.2.5分选CD4+CD25+T细胞及评估Treg细胞对效应性T淋巴细胞增殖的抑制使用CD4+CD25+Treg细胞分选试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach Germany)分选IL-33处理及未处理的Control组(n=10)、SA(n=10)组及ACS(n=10)组患者的PBMC。得到纯化的CD4+CD25+T细胞(Treg)和CD4+CD25-T细胞(Tresp)。并且通过流式检测所分选的Treg和Tresp细胞纯度≥95%。检测Treg与Tresp细胞以不同比例混合共培养(1∶1、1∶2、1∶4和1∶8)时的细胞增殖能力。同时在各组共培养细胞中均加入无增殖能力的抗原提呈细胞(105)、anti-human CD3抗体(5 μg/mL，eBioscience公司)和anti-human CD28抗体(2 μg/mL，eBioscience公司)刺激72 h。在最后16 h加入1 μL3[H]-胸腺嘧啶核苷。培养结束后用闪烁计数计(PerkinElmer)评估细胞的增殖能力，以细胞增殖抑制率反映Treg细胞对效应性T淋巴细胞增殖的抑制功能。

1.2.6RT-PCR检测PMBC的Foxp3 mRNA表达按照Trizol说明书，采用一步法提取总RNA并逆转录获得cDNA。以GAPDH为内参，使用SYBR荧光法分析Foxp3 mRNA的表达。目的基因的引物序列为：Foxp3上游5′-CACTTGCAGACACCATTTGC-3′，下游5′-CTCTTCTTCCTTG-AACCCCA-3′；IFN-γ上游5′-TTTGGGTTCTCTTGGCTGTT-3′，下游5′-TCTTTTGGATGCTCTGGTCA-3′；IL-4上游5′-TGCCTCCAAGAACAC-AACTG-3′，下游5′-ACTCTGGTTGGCTTCCTTCA-3′；IL-17上游5′-ACCAATCCCAAAAGG-TCCTC-3′，下游5′-TGGATGGGGACAGAGTT-CAT-3′；GAPDH上游5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′；下游5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。用2-ΔΔCt分析Foxp3 mRNA的相对表达。

1.3统计学分析

2结果

2.1临床资料比较

各组患者在年龄、性别、危险因素及药物服用等方面的比较中差异均无统计学意义(表1)。

表1　各组患者基本资料±s)

Control：对照组；SA：稳定性心绞痛；ACS：急性冠脉综合征；TC：总胆固醇；TG：总甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白；HDL-C：高密度脂蛋白；CCB：钙离子拮抗剂；ACEI：血管紧张素转换酶抑制剂；ARB：血管紧张素受体阻断剂

2.2未经IL-33处理PBMC中Treg细胞比例及抑制功能

各组患者的PBMC在体外培养3 d后收集，通过流式检测发现Control组(n=36)、SA组(n=30)及ACS组(n=41)患者PBMC中CD4+CD25+T细胞百分比差异无统计学意义(P=0.28，图1A)。随后分析了Foxp3在各组CD4+CD25+T细胞的表达，与Control组(80.19±5.21)%和SA组(78.2±9.34)%相比，Foxp3在ACS组中CD4+CD25+T细胞的表达明显减少[(42.6±56.33)%，P<0.01，图1B]。同时通过对Foxp3 mRNA表达的分析也证实了上述结果(图1C)。

从Control组(n=10)、SA组(n=10)和ACS组(n=10)患者体外培养的PBMC中经磁珠分选得到纯化的Treg细胞和Tresp细胞(纯度≥95%)。通过检测细胞单独培养增殖能力，发现各组之间Treg细胞(P=0.64)和Tresp细胞(P=0.80)的增殖的差异无统计学意义(图1D)。然而Treg细胞和自身Tresp细胞以不同比例(1∶1、1∶2、1∶4和1∶8)共培养后，发现来自ACS组的Treg细胞抑制功能明显降低(P<0.05，图1E)。

A：以CD4+T细胞设门，各组患者CD4+CD25+T细胞在CD4+T细胞中的比例流式代表图；B：以CD4+CD25+T细胞设门，Foxp3在CD4+CD25+T细胞中表达的流式代表图；C：Foxp3 mRNA的表达；D：Treg细胞及Tresp细胞增殖能力比较；E：各组患者Treg细胞与Tresp细胞以不同比例共培养后抑制功能比较；*P<0.05 **P<0.01图1　各组患者Treg细胞百分比的流式细胞代表图及功能检测Fig.1 Flow cytometry analysis of the proportion of Treg cells and the testing of Treg cells function in patients of each group

2.3未经IL-33处理PBMC中Th1、Th2、Th17细胞比例

收集Control组(n=36)、SA组(n=30)及ACS组(n=41)患者体外未接受IL-33处理的PBMC。与Control组相比，ACS组患者中Th1(21.3±1.67)%和Th17(2.96±1.28)%细胞比例明显升高(P<0.01，图2A和2C)。而Control组与SA组之间，Th1(P=0.62)和Th17(P=0.75)细胞比例差异没有统计学意义。同时并未发现3组之间Th2细胞的比例有统计学差异(P=0.66，图2B)。

2.4IL-33对各组患者PBMC中Treg细胞的影响

在接受IL-33处理3 d后，收集Control组(n=36)、SA组(n=30)及ACS组(n=41)患者PBMC。通过流式细胞术检测，与未IL-33处理组相比，ACS组患者PBMC经IL-33共培养后CD4+CD25+T细胞中Foxp3的表达明显升高(P<0.01)，而Control组和SA组表达无明显改变(P=0.68，P=0.71)，见图3A。同时，我们通过RT-PCR检测IL-33作用前后各组Foxp3 mRNA的表达也证实了上述结果(图3B)。通过检测分选IL-33处理后Control组(n=10)、SA组(n=10)和ACS组(n=10)患者的CD4+CD25+T细胞，发现IL-33增强了ACS患者CD4+CD25+T细胞中Treg细胞的抑制能力。经IL-33处理后，Treg细胞和自身Treg细胞以不同比例共培养，各组患者的Treg细胞的抑制能力在Treg∶Tresp为1∶1、1∶2、1∶4时均没有统计学差异(P=0.17、P=0.34、P=0.26图3C)，而在1∶8时，对照组与ACS组、ACS组与SA组间差异均有统计学意义(均P<0.01)。

2.5IL-33处理后各组患者PBMC中Th1、Th2、Th17细胞比例改变

与未接受IL-33处理相比，IL-33处理后明显降低了各组患者PBMC中Th1和Th17的比例(P<0.01)，同时明显促进了各组患者Th2细胞的比例(P<0.01)，见图4A。通过RT-PCR技术检验了Th1、Th2、Th17细胞中特征性细胞因子基因的表达，发现与未接受IL-33处理相比，各组患者Th1细胞特征性细胞因子IFN-γ和Th17细胞特征性细胞因子IL-17的基因表达量明显下降(P<0.01)，而Th2细胞的特征性细胞因子IL-4的基因表达显著升高(P<0.01)，见图4B。

A：各组患者Th1细胞在CD4+T细胞中比例的流式代表图；B：各组患者Th2细胞在CD4+T细胞中比例的流式代表图；C：各组患者Th17细胞在CD4+T细胞中比例的流式代表图图2　各组患者PBMC中Th1、Th2、Th17细胞比例的流式代表图Fig.2 Flow cytometry analysis of the proportions of Th1，Th2，Th17 cells in PBMCs of patients in each group

A：Foxp3在CD4+CD25+T细胞中的表达；B：Foxp3 mRNA的表达；C：IL-33处理后各组患者Treg细胞与不同比例Tresps共培养后抑制功能比较；**P<0.01图3　IL-33对各组患者外周血Treg细胞的修复作用Fig.3 The repairing role of IL-33 in peripheral Treg cells of patients in each group

A：各组患者PBMC中Th1、Th2、Th17细胞比例的变化；B：Th1、Th2、Th17细胞特征性细胞因子基因表达的改变；**P<0.01图4　IL-33对各组患者PBMC中Th1、Th2、Th17细胞比例的影响Fig.4 Effects of IL-33 on the proportions of Th1，Th2，Th17 cells in PBMCs in patients of each group

3讨论

ACS有着共同的病理生理学基础，即在冠状动脉硬化的基础上，发生斑块的破裂或糜烂、溃疡，并发血栓形成、血管收缩、微血栓栓塞等导致急性或者亚急性的心肌供氧减少。而冠状动脉粥样斑块不稳定的一个重要原因为活化的炎症性CD4+T淋巴细胞在斑块和外周血中的聚集。同时之前的研究表明在ACS患者的粥样斑块和外周血中存在着明显增加的Th1和Th17细胞[2-3]。Treg细胞是不同于Th1、Th2及Th17的一群CD4+T细胞，在正常状况下Treg可以通过有效抑制Th1及Th17的过度增殖来维持外周的免疫稳态。

本研究检测了各组患者外周血中CD4+CD25+T淋巴细胞的比例，却意外发现各组之间没有统计学差异。随后通过检测Foxp3在CD4+CD25+T细胞的表达，发现ACS患者中Foxp3+CD4+CD25+T细胞的比例显著减少。同时评估了各组患者CD4+CD25+T细胞中Treg细胞的抑制功能，结果显示ACS患者中Treg细胞抑制能力也显著降低。Treg细胞是维持外周免疫平衡主要的调节性T淋巴细胞，Treg细胞数量减少和抑制功能受损导致无法有效抑制Th1和Th17细胞的过度增殖。本研究也证实，ACS患者PBMC中Th1和Th17细胞比例明显高于Control组和SA组。而过度增殖的Th1和Th17可以通过分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-6、基质金属蛋白酶等炎性因子来活化巨噬细胞、抑制平滑肌细胞增殖及胶原合成从而造成斑块的破裂[5-7]。因此积极抑制Th1和Th17细胞过度增殖并促进Treg细胞数量和功能的恢复将成为控制ACS发展的有效措施。

IL-33作为IL-1家族的新成员，可以通过与ST2受体特异性结合，作用于淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞等从而发挥免疫调节作用；也可以作为一个细胞内核因子通过调节核转录因子的表达发挥作用。体内体外研究已经证实，IL-33可以有效上调Th2细胞的比例及Th2型细胞因子的分泌，促进Th2细胞免疫应答，从而在多种疾病中发挥着免疫调节作用[8-9]。尽管目前对于Th2细胞在动脉粥样硬化中的作用还存在一定的争议，然而众多的动物实验倾向于有效提高ApoE-/-小鼠体内的Th2细胞水平可以在动脉粥样硬化的病理过程中起到保护作用[10]。本研究发现IL-33可有效促进各组患者PBMC中Th2细胞的比例，并有效降低Th1和Th17细胞的比例，此结果与Miller等[4]关于IL-33在ApoE-/-小鼠体内研究的结论一致。有研究证实IL-33可以通过活化树突状细胞进而促进初始T淋巴细胞向Th2细胞转化，提高Th2细胞的比例[11]。IL-33同时可以刺激IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子的分泌，而这些细胞因子对Th2的转化具有促进作用[12]。此外，IL-33还具有直接调节GATA-3表达的作用[13]。通过上述机制，IL-33可以有效调节体内Th2细胞及相关细胞因子的水平，从而抑制动脉粥样硬化的进程和稳定斑块。

对于Treg细胞在动脉粥样硬化和稳定斑块中的保护作用已经被广泛接受[14-15]。本研究分析了IL-33处理后各组患者Treg细胞数量及功能的变化，发现IL-33可以明显增加ACS患者PBMC中Treg细胞的水平及有效修复Treg细胞的抑制功能。这个结果跟Wasserman等[16]的研究结果一致，通过刺激IL-33信号系统可以有效地提高Treg细胞的比例。ACS患者PBMC中的Treg细胞在IL-33的有效修复后，可通过与辅助性T淋巴细胞接触及分泌抑制性细胞因子来阻止Th1和Th17细胞的增殖，本研究显示ACS患者PBMC中的Th1和Th17细胞的比例下降程度明显高于Control组和SA组。根据Matta[17]及Brunner[18]等的研究结果，IL-33可能通过诱导树突状细胞转变表型及分泌IL-2来扩增Treg细胞的数量。同时Schiering等[19]的研究指出IL-33可通过直接活化并招募GATA3结合到Foxp3的促进子从而调节Foxp3的表达，而且证实了IL-33信号通路在Treg细胞的抑制功能上发挥着重要作用。因此IL-33可以通过调节ACS患者Treg细胞数目及功能来干预动脉粥样斑块的进展和稳定。

综上所述，ACS患者体内Treg细胞数目的减少及抑制功能受损使其不能有效抑制Th1和Th17细胞的过度增殖，造成动脉粥样斑块的不稳定及ACS症状的发生。而IL-33可以通过扩增Treg细胞的数目及修复Treg细胞受损的抑制功能，上调Th2细胞的比例，控制免疫反应，改善ACS患者体内的免疫失衡。因此，IL-33有望成为ACS治疗的新靶点。

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(2015-07-28收稿)

Immunoregulatory Role of Interleukin-33 in Patients with Acute Coronary Syndrome

Xiong Xiaofang，Huang Chunyan，Li Junetal

DepartmentofCardiology，Wuhan3rdHospital，Wuhan430060，China

AbstractObjectiveTo explore the immunoregulatory role of interleukin-33(IL-33)in patients with acute coronary syndrome(ACS)and its underlying mechanisms.MethodsA total of 137 patients who underwent coronary angiography in our hospital were recruited in the study.They were divided into control group，stable angina(SA)group and acute coronary syndrome(ACS)group.The peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)were isolated from all subjects and cultured in the presence of IL-33 or not for 3 days.The proportions of T-helper 1(Th1)，Th2，Th17 and Treg cells were detected by flow cyotometry.The proliferation of Treg cells was measured by3[H]-thymidine uptake.Foxp3 mRNA expression was analyzed by real-time polymerase chain reaction.Results①The proportion of Treg cells was significantly decreased，their function of inhibiting the proliferation of effector T lymphocytes was severely damaged，and Th1 and Th17 cells proliferated excessively in the ACS group when compared with control and SA groups.②The proportions of Treg and Th2 cells were profoundly increased and the function of Treg cells recovered after IL-33 treatment.ConclusionIL-33 effectively regulates the immune imbalance in patients with ACS by upregulating the frequencies of Th2 cells and restoring the impaired Treg cells.

Key wordsacute coronary syndrome；interleukin-33；immunoregulation

中图分类号：R543.3

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.018

*武汉市卫计委科研基金资助项目(No.WX15A03)

熊晓昉，男，1980年生，主治医师，医学硕士，E-mail：xxf104622@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：jwen70@163.com