湖北省2007～2012年H3N2流感病毒HA基因及抗原性分析

梁　杨，　霍细香，　方　斌，　刘琳琳，　陈盛杰，　刘　准，　陈　丹△

1武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉　430065　2湖北省疾病预防控制中心，武汉　430079

湖北省2007～2012年H3N2流感病毒HA基因及抗原性分析

梁杨1，2，霍细香2，方斌2，刘琳琳2，陈盛杰1，刘准1，陈丹1△

1武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉4300652湖北省疾病预防控制中心，武汉430079

摘要：目的研究湖北省2007～2012年H3N2流感病毒HA基因变异及抗原性变化情况。方法选取2007～2012年分离的湖北省各地区H3N2流感病毒39株，提取病毒RNA，运用RT-PCR技术扩增HA基因并测定序列，软件导出其核苷酸、氨基酸序列，采用MEGA5.2构建进化树，用红细胞凝集抑制实验检测病毒的抗原性。结果14株毒株红细胞凝集抑制结果显示效价与参照抗原有4倍以上的差异，提示H3N2流感病毒存在抗原性变异；核苷酸有较高的同源性，为97%～99%；HA1区共有50个氨基酸发生改变，其中37个在抗原位点，受体结合位点有2个(194、225位)，抗原决定簇A区4个，B区6个，C区2个，D、E区各1个；糖基化位点有明显的地域差异，不同地区糖基化位点的数量和位置均不相同。结论湖北省2007～2012年间H3N2流感病毒抗原性和HA基因存在变异。

关键词：H3N2流感病毒；HA基因变异；抗原性分析

流行性感冒是由流感病毒引起的急性上呼吸道传染病，是第一个实行全球监测但目前尚不能有效控制的世界性传染病[1]。流感病毒中致病率和死亡率最高的是甲型流感病毒，其众多亚型中，H3N2亚型在猪群、禽类和人群中均有分布，变异最为活跃，研究显示在全球流感病例中，感染H3N2亚型人流感病毒的患者人数排名第一[2]。H3N2流感病毒为分节段单股负链RNA，其中第4节段HA蛋白与疾病发生和流行最为密切，对病毒的变异、毒力、受体识别和宿主特异性均有决定性作用[3]，其高发的点突变率和基因重排是流感流行的主要原因之一[4]，同时HA的抗原性是流感监测和疫苗选择的重点和依据[5]，因此，H3N2流感病毒HA基因和抗原性的研究对防控流感的流行具有重要意义。从近几年湖北省流感流行状况分析，H3N2流感病毒表现活跃，我们通过对湖北省2007～2012年H3N2流感病毒HA基因变异和抗原性改变的研究，阐明了H3N2流感病毒变异的特征，为湖北省制订流感防治策略提供科学依据。

1材料与方法

1.1标本来源

选取2007～2012年分离获得的39株H3N2流感病毒毒株，毒株经湖北省疾病预防控制中心鉴定、中国国家流感中心复核确认，毒株均为MDCK细胞分离株，其中2007年7株、2008年9株、2009年7株、2010年6株、2011年2株、2012年8株；来自哨点医院毒株37株，爆发疫情毒株2株，相同年份毒株选自不同月份、不同年龄段分离株。2011年因全年获取的毒株数较少，仅选取2株进行检测分析。

1.2单向红细胞凝集抑制实验

选择A/福建同安/196/2009(H3N2)作为标准血清，对所选毒株进行单向红细胞凝集抑制实验(HI)，选取A/Hubei/Jingzhou/0779/2012(H3N2)为参照抗原，若待测毒株效价与参照抗原效价相比，有4倍或4倍以上的差异，可初步判断毒株间抗原性存在差异。采用1.5%豚鼠红细胞，按照《全国流感监测技术指南》(2011版)进行实验。

1.3病毒核酸提取

采用磁珠法提核酸，以Qiagen公司EZ1型自动核酸仪提取病毒RNA。

1.4RT-PCR扩增病毒HA基因

引物选择：根据H3N2亚型流感病毒HA基因长度选定4对引物，分别为HA-F-1BM13：TGTAAAACGACGGCCAGTAGCARAAGCAGGGGA，HA-R-850M13：CAGGAAACAGCTATGACCTAACCYCGAGGAGCRATTAG；HA-F-391M13：T-GTAAAACGACGGCCAGTTATGCCTCCCTTA-GGTCACTAG，HA-R-949M13：CAGGAAACA-GCTATGACCTCATTGGRAATGCTTCCATTT-GG；HA-F-872M13：TGTAAAACGACGGCCAGTAAGCTCRATAATGAGRTCAGAT，HA-R-1425M13：CAGGAAACAGCTATGACCAGTCAGTYAGATSA-ATTGTATGTTG；HA-F-1255M13：TGTAAA-ACGACGGCCAGTTCCATCARATYGAAAARG-AATTC，HA-R-1778BM13：CA-GGAAACAGCTATGACCAGTAGAAACAAGGGTGTTTT。

扩增试剂盒采用Promega Access，PCR反应条件为逆转录45℃ 45 min，酶灭活94℃ 2 min，变性94℃ 30 s，退火58℃ 1 min，延伸68℃ 2 min，变性、退火、延伸共45个循环，最后68℃ 7 min收获。扩增仪为美国MJ Research公司的PTC-200型PCR仪。

1.5扩增产物序列鉴定与测定分析

扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，选取清晰且无杂带的目的条带，交由华大基因武汉分公司完成测序。

1.6序列分析

采用DNA Star进行序列拼接，使用Bioedit对核苷酸与氨基酸进行比对分析，糖基化位点用NetNGlyc 1.0 server分析，采用MEGA5.2软件以N-J法(Bootstrap replicates：1000)构建进化树。

2结果

2.1HA抗原性分析

39株病毒中有3株病毒血凝结果为阴性，分别为A/Jingzhou/0088/2007(H3N2)、A/Jingzhou/0087/2008(H3N2)和A/Jingzhou/0294/2007(H3N2)，但基因测序可获得序列。其余36株毒株的HI结果如表1所示。有14株毒株抗原性发生改变，主要集中在2007、2008年，2009年以后毒株抗原性并未有较大的改变。2012年有1株发生变异，说明相同年份毒株也有差异。

2.2HA基因分析

2.2.1核酸同源性此次所测的流感病毒毒株HA基因长度为1 753 bp，编码567个氨基酸。利用软件将测得毒株的核苷酸序列与同时期(2007～2012年)的标准疫苗株进行比对，将结果在NCBI进行BLAST分析得到较高的同源性，其同源性范围在97%～99%之间，不同年代的毒株与同年推荐的标准疫苗株同源性最高，达99%。

2.2.2氨基酸变异①糖基化位点：湖北地区H3N2流感病毒的糖基化位点有明显的地域差别。硚口和江岸地区毒株有9个保守的糖基化位点，分别是39、53、94、157、164、196、277、316、514位，2010年在309位增加了1个糖基化位点但很快消失，此后在69、76位增加了2个潜在的糖基化位点，并一直保留至2012年的毒株中，但2012年的毒株中A/Jiangan/1361/2012(H3N2)和A/Jiangan/1361/2012(H3N2)在157位缺失。荆州和当阳地区毒株也是有9个保守的糖基化位点，分别是40、54、95、158、165、197、278、317、515位，除2012年的3株毒株增加了70、77这2个糖基化位点外其他基本无变化。而湖北宜都的毒株糖基化位点则为36、50、66、73、91、154、161、172、193、274、313、511位，共12个糖基化位点，与本研究湖北其他地区毒株在数量和位置上都不相同。总之，2012年湖北地区所选取毒株的糖基化位点都发生了变化，增加和缺失的糖链可能对蛋白质的抗原性和对宿主的识别产生影响，应密切关注毒株的变异趋势。

②抗原位点、抗原决定簇、受体结合部位：本次研究结果显示HA1区共有50个氨基酸位点发生突变，其中已知的抗原位点有37个，占大部分的突变位点，过多的抗原位点发生基因突变将会产生抗原性变异，常引起流感大流行。抗原决定簇共有14个位点发生突变，包括A区(140、142、144、145)，B区(157、158、159、189、194、198)，C区(53、278)，D区(207)和E区(81)位点。受体结合部位有2个位点发生突变，即194和225位，其中194位于抗原决定簇B区，225在非抗原区。

2007～2008年共有15个氨基酸位点发生突变(表2)，分别是L3F、G50E、D53N、Q57H/K、V112I、S124N、G138A、K140I、G142R、D144N、K158R/N、K173E/N/Q、V182I、A198T/P、I260M，其中有13个突变发生在抗原位点。2008～2009年有21个氨基酸位点发生突变，占氨基酸总变异的50%。2009～2010年26个氨基酸位点发生突变，有9个在抗原决定簇区，分别为D53N、N278K(C区)，N81D(E区)，S157L、K158N、S159F、N189K、L194P(B区)和Q207K(D区)，其中194号为受体结合位点。2010～2011年有19个氨基酸位点发生突变，但在抗原决定簇区域只有4个位点突变，此次变异并未引起大的流行。2011～2012年共有17个氨基酸位点发生突变，2011年H3N2病毒在抗原位点N45S、T47S、T48I、H94Y、A/P198S、T280E发生改变。

2.3进化树分析

系统进化树显示年份越近的毒株进化距离越近，如图1所示，2007～2012年6年间分离的毒株主要有5个分支，且都与前一个时期或同时期的标准疫苗株相吻合。第1个分支为2007年的一部分毒株，与上一个时期的标准疫苗株A/Wisconsin/67/2005(H3N2)、A/California/7/2004(H3N2)在一个树枝上。第2个分支为剩下的2007年的毒株和一部分2008年毒株，与标准疫苗株A/Brisbane/10/2007(H3N2)在一个树枝上。第3个分支为一部分2009和一部分2010年毒株组成，与标准疫苗株A/Perth/16/2009(H3N2)在一个树枝上。第4个分支为2010和2011年的4个毒株，没有相应的标准疫苗株与之对应。第5分支为全部2011和全部2012年毒株，与标准疫苗株A/Texas/50/2012(H3N2)在一个树枝上。在5个分支外仍有几株游离在外，分别是A/Jingzhou/0139/2008(H3N2)、A/Jingzhou/0149/2008(H3N2)、A/Jiangan/1384/2009(H3N2)、A/Jiangan/0195/2009(H3N2)和A/Jiangan/1124/2009(H3N2)。

表1　2007～2012年湖北省H3N2流感病毒红细胞凝集抑制实验结果

*为参照抗原

表2　湖北省2007～2012年H3N2流感病毒与疫苗株A/Texas/50/2012氨基酸位点变异情况

病毒株氨基酸位点106112121124128138140142144145157158159疫苗株AVNSNAIRNNLNF2007年株TG/AK/IG/R〛D/N〛〛S/L〛K〛2008年株I/VN/ST〛〛〛S/L〛R/K/N〛2009年株T〛K/N〛〛S/L〛KN〛S/F2010年株N/ST〛K/N〛〛〛〛2011年株V/AT〛〛〛〛〛2012年株S/NA/T/NG/R〛〛S/N〛〛〛

病毒株氨基酸位点162173182186189194198199204207212213219疫苗株PQVVKLPSVKAVF2007年株KGNA〛〛〛T〛〛S2008年株E/K/N/QI/VGNA/T/P〛〛〛T〛〛S2009年株P/QGN/KA〛〛Q/K〛T/A〛A/V〛S2010年株S/PGP/LA〛I/V〛〛T/A〛〛S2011年株GA/S/PP/S〛〛〛〛〛S2012年株GS〛〛〛〛〛S

病毒株氨基酸位点221223225230260261262269278280312疫苗株PINIIRSRKES2007年株V〛N〛〛N2008年株VM/I〛N〛〛N2009年株V/ID/NM/IR/SK/R〛N〛G/E〛N2010年株L/PVV/IM/IQ/R〛N/K〛A/T/E〛N2011年株V/IV/I〛N/K〛T/E〛N/S2012年株L/PM/I〛〛〛

蓝色为抗原决定簇A区；黄色为抗原决定簇B区；橙色为抗原决定簇C区；红色为抗原决定簇D区；绿色为抗原决定簇E区

3讨论

流感病毒变异频繁，变异幅度大，病毒的不断变异导致的抗原漂移和抗原转变对人类防治流感流行和疫苗的配制带来重大的挑战[6-7]。流感病毒的主要表面抗原为HA抗原，HA能引起红细胞凝集，利用流感病毒能与特异性抗血清发生红细胞凝集抑制(HI)的原理，了解其抗原性变异的动态，对流感防治及诊断均具有十分重要的意义。同时，实时监测基因和核苷酸多样性可以为公共卫生机构间接评估流感流行提供依据[8]。

湖北省2007～2012年间的H3N2流感病毒虽然与同时期的疫苗株有较高的核苷酸同源性，达97%～99%，但血凝抑制结果存在4倍以上差异，说明发生了抗原漂移。2007～2008年毒株氨基酸在F3L、N53D、H/K57Q、I112V、N124S、I182V、T/P198A等位点变异后，2009年又增加了14个新的氨基酸位点突变，包括受体结合位点N225D，表明HA基因突变的数量、关键突变点的性质和位置在抗原漂移中起重要作用[9]。2009年为新甲型H1N1流感大流行年，但湖北省也伴随有H3N2流感同时流行，多种流感病毒混合感染导致基因重组是产生较多的氨基酸变异的主要原因[10]。2010～2011年流感并未产生大流行，可能与2010年H3N2流感病毒流行后人群产生抵抗力有关[10]。2011年不同于2007～2012年任何一年，虽然突变发生但并未引起流感流行，说明流感病毒致病性和大流行需要某些特定抗原位点的保守遗传[11]。湖北地区2007～2012年间每年流感病毒株的氨基酸有较大程度的变异，抗原性也存在变异，但并不是每次变异都引起流感大的流行，也证实了流感病毒的抗原性与氨基酸某些关键位点有关。

图1　湖北省2007～2012年H3N2流感病毒HA基因进化树Fig.1 The evolutionary tree of HA gene in H3N2 viruses obtained in Hubei province during 2007-2012

H3N2流感病毒HA1抗原决定簇有5个区，A区包括133～137位和140～146位形成的突出的环上，B区位于155位上的主环156～160位及球区末端围绕着a螺旋结构的187～198位，C区位于球区下方的53、54、275、278位，由52位和277位的形成的膨胀部分所在区，D区位于HA三聚体的交界处由207位和174位组成，E区由63、78、81、83位组成[12]。抗原位点和受体结合位点均位于HA蛋白的重链区，即HA1区[13]。在HA1蛋白中，至少有4个以上氨基酸序列发生替换，且5个抗原决定簇中，至少有3个不同位点发生改变时，才有可能导致流感流行[14]。本研究显示每年氨基酸突变主要集中在抗原位点和抗原决定簇A和B区，同时受体结合位点也有2个位点发生变异，说明抗原决定簇A和B以及受体结合位点在流感病毒的进化中起相对重要的作用[15]。除了抗原决定簇和受体结合位点的突变对毒株抗原性起决定作用，某些非抗原位点的突变也有重大意义[16]，如106、112、199位。而且某些氨基酸位点如F3L、N53D、H/K57Q、I112V、N124S、I182V、T/P198A在变异后隔年又变回去，证明了H3N2流感氨基酸变异在人群中的循环特性。湖北地区流感毒株的糖基化位点存在明显的地域差别，不同地区糖基化位点的数量和位置都有所不同，同地区2012年的毒株糖基化位点都有1～2个增加，增加的糖基化位点很可能是为了逃避宿主免疫应答的正向选择，而157位糖基化位点的缺失对抗体识别也可能产生重要影响[17]。进化树显示毒株基本上是与当年或头年推荐的疫苗株在同一分支上，除少数几株游离在外，但这几株毒株并非疫情来源，说明每年的疫苗株对人群有一定的保护作用。进化树与抗原性变异之间也可以看出，进化距离越大，红细胞凝集抑制差别越大。湖北省2007～2012年H3N2流感病毒是隔年交替流行的，本研究显示其流行的主要原因有：①抗原位点的保守遗传；②多种病毒混合感染；③一定数量的抗原决定簇和抗原位点的突变；④人群的抵抗力。并不是每次突变都引起大的流行，只有在特定的氨基酸位点发生突变且有相应数量的抗原决定簇位点的改变才能引起大的流行，是否会产生使毒力更强的流行株或产生新的毒株还有待进一步研究。分子流行病学资料表明，流感病毒的HAl蛋白编码区的变异频率远远高于病毒的其他蛋白，抗原漂移是流感流行的预兆，因此密切监测HAl区基因的变异情况，将对流感预测、预防和疫苗株的筛选有着十分重要的参考价值[18]。

我们通过对湖北省2007～2012年的H3N2流感病毒的研究，对流感变异的趋势有了一定的了解，为湖北省未来对流感的防控提供了理论依据，同时也为中国其他地区流感流行的研究提供了参考。但本次研究毒株数量有限，毒株来源地区也不够广泛，使得研究有一定的局限性，需要扩大范围进行深入研究。

参考文献

[1]Griffin B A，Jain A K，Davies-Cole J，et al.Early detection of influenza outbreaks using the DC Department of Health’s syndromic surveillance system[J].BMC Public Health，2009，9：483.

[2]Rambaut A，Pybus O G，Nelson M I，et al.The genomic and epidemiological dynamics of human influenza A virus[J].Nature，2008，453(7195)：615-619.

[3]Knossow M，Skehel J J.Variation and infectivity neutralization in influenza[J].Immunology，2006，119(1)：1-7.

[4]Bizabard T，Gigant B，Rigolet P，et a1.Structure of influenza virus hemagglutinin complexed with a neutralizing antibody[J].Nature，1995，376(6535)：92-94.

[5]董丽波，张烨，温乐英，等.1995～2005年中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行相关性研究[J].病毒学报，2007，24(5)：339-344.

[6]Schweiger B，Zadow I，Heckler R.Antigenic drift and variability of influenza viruses[J].Med Microbiol Immunol，2002，191(3/4)：133-138.

[7]Stray S J，Pittman L B.Subtype-and antigenic site-specific di-fferences in biophysical influences on evolution of influenza virus hemagglutinin[J].Virology J，2012，9(1)：188-196.

[8]Aris-Brosou S.Inferring influenza global transmission networks without complete phylogenetic information[J].Evol Appl，2014，7(3)：403-412.

[9]Ann J，Papenburg J，Bouhy X，et al.Molecular and antigenic evolution of human influenza A/H3N2 viruses in Quebec，Canada，2009-2011[J].J Clin Virol，2012，53(1)：88-92.

[10]张磊.北京地区甲型流感病毒的流行病学及抗原变异研究[D].吉首：吉首大学，2011.

[11]Righetto I，Milani A，Cattoli G，et al.Comparative structural analysis of haemagglutinin proteins from type A influenza viruses：conserved and variable features[J].BMC Bioinformatics，2014，15(1)：1-17.

[12]Wiley D C，Wilson I A，Skehel J J.Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza hemagglutinin and their involvement in antigenic variation[J].Nature，1981，289(5796)：373-378.

[13]Günther I，Glatthaar B，Döller G，et al.A H1 hemagglutinin of a human influenza A virus with a carbohydrate modulated receptor binding site and an unusual cleavages site[J].Virus Res，1993，27(2)：147-160.

[14]Bush R M，Bender C A，Subbarao K，et a1.Predicting the evolution of human influenza A[J].J Heredity，2000，91(3)：1921-1925.

[15]Wilson I A，Cox N J.Structural basis of immune recognition of influenza virus hemagglutinin[J].Annu Rev Immunol，1990，8(8)：737-771.

[16]Huang P，Liang L J，Hou N M，et al.Phylogenetic，molecular and drug-sensitivity analysis of HA and NA genes of human H3N2 influenza A viruses in Guangdong，China，2007-2011[J].Epidemiol Infect，2013，141(5)：1061-1069.

[17]Suzuki Y.Positive selection for gains of N-linked glycosylation sites in hemagglutinin during evolution of H3N2 human influenza A virus[J].Genes Genet Syst，2011，86(5)：287-294.[18]严菊英，卢亦愚，周敏，等.浙江省近几年甲3型流行性感冒病毒株HAl基因特性分析[J].中国计划免疫，2003，9(5)：272-276.

(2015-12-30收稿)

Analysis of HA Gene and Antigenicity of Influenza H3N2 Virus in 2007-2012，Hubei Province

Liang Yang1，2，Huo Xixiang2，Fang Bin2etal

1SchoolofPublicHealth，WuhanUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430065，China2HubeiProvincialCenterforDiseasesControlandPrevention，Wuhan430079，China

AbstractObjectiveTo investigate the variation of HA gene and antigenicity of influenza H3N2 viruses in Hubei province during 2007-2012.MethodsRNA was extracted from 39 strains of influenza H3N2 viruses obtained from different areas in Hubei province during 2007-2012.The HA gene was amplified with RT-PCR and sequenced.The amino acid and nucleotide sequences were obtained by using the software.Then the evolutionary tree was constructed via MEGA 5.2.The antigenicity of the strains was determined by hemagglutination inhibition(HI)test.ResultsHI test results showed that there was a difference of more than 4 times in the antibody titer between the samples and the standard antigen，suggesting the antigenic variation of H3N2 flu viruses.The nucleotide homology was high，and reached 97%-99%.Fifty amino acids changed in the HA1 segment，including 37 in antigen sites，2 in receptor binding sites(194，225)，4 in the antigenic determinant area A，6 in area B，2 in area C and 1 in area D and E each.There were significant differences in the number and position of glycosylation sites between different regions.ConclusionThere were variations in HA gene and antigenicity in H3N2 virus in Hubei province during 2007-2012.

Key wordsinfluenza H3N2 virus；HA genetic variation；antigenicity

中图分类号：R181.36

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.011

梁杨，女，1988年生，医学硕士，E-mail：443757863@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：409175069@qq.com