shRNA沉默TRAF6基因对急性肝损伤小鼠炎症反应的影响

陈　锋，　张芙蓉△，　何生松，　庞　然，　许娟娟，　董继华

1武汉市妇女儿童医疗保健中心(武汉市儿童医院)重症医学科，武汉　430016　华中科技大学同济医学院附属协和医院 2感染科 3消化内科 4中心实验室，武汉　430022

shRNA沉默TRAF6基因对急性肝损伤小鼠炎症反应的影响

陈锋1，张芙蓉1△，何生松2，庞然2，许娟娟3，董继华4

1武汉市妇女儿童医疗保健中心(武汉市儿童医院)重症医学科，武汉430016华中科技大学同济医学院附属协和医院2感染科3消化内科4中心实验室，武汉430022

摘要：目的通过shRNA沉默肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumour necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)基因表达，研究TRAF6沉默基因对内毒素/D-氨基半乳糖(LPS/D-GalN)诱导的急性肝衰竭小鼠炎症反应的影响。方法通过体外实验筛选针对TRAF6基因的最有效小干扰RNA(siRNA)序列，采用流体力学注射法将pTRAF6-shRNA表达质粒转染BALB/c小鼠，24 h后重复注射1次。第2次注射后24 h，予LPS/D-GalN腹腔注射制备急性肝衰竭内毒素炎症模型。设正常对照组、模型对照组、空白质粒/LPS组及RNAi/LPS组。观察各组小鼠肝脏病理变化，Real-time PCR检测TRAF6、IL-6及COX-2 mRNA的表达，ELISA检测血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平变化，Western blot检测肝细胞TRAF6、NF-κB p65的表达。结果Real-time PCR及Western blot检测显示，pTRAF6-shRNA1能有效沉默TRAF6 mRNA及蛋白表达，其中TRAF6 mRNA表达较正常小鼠下降约60.13%，TRAF6蛋白表达降低约52.08%，差异均有统计学意义(均P<0.01)。ELISA检测显示各组小鼠TNF-α、IL-1β均于造模后8 h达到峰值，TGF-β1于16 h达到峰值；RNAi/LPS组小鼠血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平明显低于同时间点模型对照组。Real-time PCR结果显示RNAi/LPS组小鼠IL-6、COX-2及TRAF6 mRNA表达下降，与模型对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.01)。Western blot结果显示RNAi/LPS组小鼠肝组织总蛋白NF-κB p65表达水平显著高于正常对照组(P<0.05)，与模型对照组无差异，而胞核NF-κB p65明显低于模型对照组(P<0.05)。结论pTRAF6-shRNA可能通过下调NF-κB p65水平，抑制炎症相关细胞因子和炎性介质表达水平，从而减轻内毒素/半乳糖诱导的小鼠急性肝损伤。

关键词：TRAF6；RNA干扰；TLR4信号通路；NF-κB；急性肝衰竭

急性肝功能衰竭(acute liver failure，ALF)是临床危重疾患之一，目前的内科综合治疗效果不理想，病死率高达80%。目前普遍认为，由内毒素(lipopolysaccharide，LPS)诱导的以肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)为核心的炎症反应在肝衰竭中扮演着重要的角色[1-2]，上调这些细胞因子是机体防御细菌感染的主要机制，但是过度表达可以加剧肝脏炎性损伤，导致病情恶化。因此，理论上有效阻断LPS信号转导通路对防治过度炎症反应有重要价值。TRAF6[Tumor necrosis factor(TNF)receptor-associated factor-6]作为介导NF-κB信号转导的一个关键衔接蛋白，在LPS/Toll样受体4(Toll-like receptor，TLR4)信号转导通路中发挥重要调节作用，可介导多条信号通路(TNF-α、IL-1和RANKL通路)，最终激活转录因子NF-κB、AP-1、PKB/Akt等，介导病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)引起的天然和获得性免疫及炎症反应[3-4]。因此，本实验设计构建重组质粒pGCsi-TRAF6-shRNA，利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，以内毒素/半乳糖(LPS/D-GalN)诱导的急性肝衰竭小鼠为研究对象，研究体内抑制TRAF6基因表达对急性肝衰竭内毒素炎症反应的影响。

1材料与方法

1.1材料

LPS(EscherichiacoliO111：B4)及D-氨基半乳糖购自美国Sigma公司；脂质体Trans Fectin购自美国Bio-rad公司；TRIzol、MTT、DMSO购自美国Invitrogen公司；质粒中提试剂盒购自Omega公司；逆转录试剂盒、SYBR Green Real-time PCR试剂盒购自TOYOBO公司；ELISA试剂盒(TNF-α、IL-1β、TGF-β1)购自美国Cusabio公司；TRAF6、NF-kB p65多克隆抗体购自Santa Cruz公司。

重组质粒pGCsi-TRAF6-shRNA由本实验室前期构建[5]。以GenBank已公布的小鼠TRAF6 mRNA序列(NM009424)为参考序列，用美国Invitrogen公司的在线设计软件BLOCK-iTTMRNAi Designer，筛选出4条理论上最佳siRNA序列：shRNA1(900-920)、shRNA2(1303-1323)、shRNA3(2324-2344)、shRNA4(3285-3305)。LOOP结构选用了TCAAGAG，末端以polyT作为RNA聚合酶Ⅲ终止信号，两端设计有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。shRNA寡核苷酸序列及Negative-shRNA表达载体由北京毅新兴业科技有限公司合成提供，构建的真核表达载体经酶切和测序鉴定证明完全正确。

1.2重组质粒pGCsi-TRAF6-shRNA筛选

前期实验中，将pGCsi-TRAF6-shRNA质粒分别转染入培养的RAW264.7细胞中，采用Real-time PCR及Western blot法检测TRAF6基因及蛋白的表达情况，筛选出质粒pTRAF6-shRNA1具有最佳的沉默效率[6]，且MTT检测显示，TRAF6基因沉默后，其细胞体外增殖活性无明显差异，故将质粒pTRAF6-shRNA1用于以下实验中。

1.3实验分组及处理

SPF级6～8周龄雄性BALB/c小鼠[动物质量合格证号：SCXK(鄂)2004-0007]，体质量(20±2)g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。按照随机对照原则分组，各组处理如表1所示。本实验采用流体力学注射法进行肝靶向性基因转染，即将相当于小鼠体重9%体积的液体(含质粒)于5～7 s内经鼠尾静脉均匀快速注入[7-8]。首先，将pTRAF6-shRNA1或空白质粒100 μg经脂质体包埋[质粒(g)/脂质体(L)按1∶2比例混合]后，溶于林格氏液(Ringer’s Solution)制成混合液。其中，正常对照组、模型对照组仅给予林格氏液尾静脉注射，RNAi/LPS组、空白质粒/LPS组给予含有质粒的混合液尾静脉注射，24 h后重复注射1次。第3天，除正常对照组外，各组小鼠均予LPS(20 μg/kg)联合D-GalN(600 mg/kg)腹腔注射。

另设RNAi组、空白质粒组(每组8只小鼠)，仅予pTRAF6-shRNA1或空白质粒尾静脉注射，不予LPS/D-GalN注射，用于检测质粒注射后TRAF6基因沉默效果。

分别于LPS/D-GalN注射后4、8 h，用毛细玻管由眼眶后静脉丛采血，离心后取上清冻存。LPS/D-GalN注射16 h后，将小鼠用乙醚麻醉，开腹后腹主动脉取血，离心后冻存；并取最大肝叶100～200 mg肝组织，快速冻存于液氮中备用。取同一肝叶5 mm×6 mm肝组织予4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋。切片用于行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色。

表1　动物分组及处理方法

1.4肝组织切片HE染色

肝组织固定、包埋后，制成4 μm厚的石蜡切片。HE染色后，常规脱水，透明，封片。镜下观察肝组织病理改变。

1.5细胞因子TNF-α、IL-1β、TGF-β1检测

酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1水平。按照试剂盒说明书步骤操作，应用全自动酶标定量测定仪进行检测。

1.6荧光定量PCR检测TRAF6、IL-6、COX-2 mRNA表达

提取总RNA后，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。PCR引物由应用软件Prima5.0设计(表2)，由上海生工公司合成。选用ABI 7700HT实时定量PCR仪。荧光定量PCR反应体系为25 μL，内含500 ng cDNA模板，终浓度为250 nmol/L的上下游引物及SYBR Green Realtime PCR Master Mix 12.5 μL。反应条件为94 ℃ 60 s；94 ℃ 15 s；退火15 s；70 ℃ 45 s，荧光收集，40个循环。以相对Ct值(即2-ΔΔCt)表示目的基因的相对表达量[9-10]，每个样本重复3次。

表2　荧光定量PCR引物序列

1.7Western blot检测TRAF6、NF-κB p65蛋白表达

分别取肝组织50 mg，按试剂盒说明提取肝组织总蛋白和核蛋白，-70℃保存，考马斯亮蓝法检测样品蛋白浓度。取20 μg蛋白，上样于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳后转膜，5%脱脂奶粉封闭液室温孵育45 min，分别加入抗TRAF6多抗(1：200)、NF-κB p65抗体(1：500)和β-actin蛋白抗体，4℃过夜，辣根过氧化物酶二抗(1：3 000)室温孵育1 h，显色后以β-actin为内参照，用AlphaEaseFC 4.0图像分析软件进行吸光度分析。

1.8统计学方法

2结果

2.1TRAF6 mRNA及TRAF6蛋白表达检测

荧光定量PCR检测显示(图1)，pTRAF6-shRNA1第2次质粒转染后16 h时，RNAi组小鼠肝组织TRAF6 mRNA表达比正常小鼠明显降低，TRAF6 mRNA表达受到抑制，约下降了60.13%，差异有统计学意义(P<0.01)。空白质粒对TRAF6 mRNA表达无明显影响，空白质粒组与正常小鼠比较差异无统计学意义(P>0.05)。LPS/D-GalN腹腔注射后16 h，模型对照组、空白质粒/LPS组肝组织TRAF6 mRNA表达较正常组明显增高(P<0.01)，模型对照组与空白质粒/LPS组相比差异无统计学意义(P>0.05)；造模后，RNAi/LPS组小鼠肝组织TRAF6 mRNA表达较模型对照组明显降低(P<0.01)。

A：正常对照组；B：模型对照组；C：RNAi/LPS组；D：空白质粒/LPS组；E：RNAi组；F：空白质粒组；与正常对照组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，▲▲P<0.01图1　荧光定量PCR检测TRAF6 mRNA表达变化Fig.1 Fluorescent quantitative PCR assay for detection of relative mRNA expression of TRAF6

Western blot检测(图2)显示，质粒转染后小鼠(RNAi组)的肝组织TRAF6/β-actin 积分吸光度比值为(0.49±0.21)，比正常对照组小鼠(1.02±0.16)降低了约52.08%，差异有统计学意义(均P<0.01)；空白质粒对TRAF6蛋白表达无明显影响[空白质粒组为(1.01±0.09)]，与正常小鼠比较差异无统计学意义(P>0.05)。予小鼠LPS/D-GalN腹腔注射16 h后，模型对照组(1.73±0.08)、空白质粒/LPS组(1.70±0.05)小鼠肝组织TRAF6蛋白表达较正常小鼠明显增高(P<0.01)，模型对照组与空白质粒/LPS组相比无明显差异(P>0.05)；RNAi干预小鼠(RNAi/LPS组)肝组织TRAF6蛋白表达(1.36±0.03)较模型对照组降低(P<0.05)。

1：正常对照组；2：RNAi组；3：模型对照组；4：空白质粒组；5：RNAi/LPS组；6：空白质粒/LPS组图2　各组小鼠TRAF6蛋白表达变化Fig.2 Changes of TRAF6 protein expression in mice in each group

2.2各组小鼠肝脏变化

HE染色(图3)可见，正常对照组小鼠肝小叶结构完整，肝板排列整齐，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列。模型对照组和空白质粒/LPS组小鼠肝小叶结构破坏，肝细胞出现弥漫性出血性坏死。RNAi/LPS组小鼠肝小叶结构不同程度破坏，肝细胞内可见点片状坏死，与模型对照组相比，肝细胞坏死程度明显减轻。

2.3小鼠血清细胞因子表达变化

ELISA结果(表3)显示，造模后，模型对照组小鼠血清TNF-α、IL-1β表达水平均于8 h达到高峰，而TGF-β1水平持续升高。模型对照组、空白质粒/LPS组小鼠血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1均明显升高，两组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。RNAi/LPS组小鼠血清TNF-α、IL-1β及TGF-β1浓度均显著低于同时间点模型对照组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

A：正常对照组；B：模型对照组；C：RNAi/LPS组；D：空白质粒/LPS组图3　小鼠肝组织病理变化(HE染色，×200)Fig.3 Pathological changes of mouse liver tissues(HE staining，× 200)

2.4小鼠肝组织IL-6、COX-2 mRNA的表达变化

如表4所示，LPS/D-GalN腹腔注射后16 h，模型对照组、空白质粒/LPS组肝组织IL-6、COX-2 mRNA表达均较正常对照组明显增高(均P<0.01)，模型对照组与空白质粒/LPS组相比差异均无统计学意义(均P>0.05)；RNAi/LPS组小鼠肝组织IL-6 mRNA表达较模型对照组明显降低(P<0.01)，与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。RNAi/LPS组COX-2 mRNA表达较模型对照组也有所降低(P<0.05)，但较正常对照组仍有升高，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.5Western blot检测NF-κB p65表达

造模后16 h，提取各组小鼠肝组织总蛋白和核蛋白，并定量。Western blot结果(图4、表5)显示，正常对照组总蛋白和核蛋白内NF-κB p65表达水平较低；模型对照组总蛋白和核蛋白NF-κB p65表达水平明显增高，且胞核与总蛋白中NF-κB p65比值增加，提示急性肝衰竭小鼠NF-κB活性表达增加。空白质粒/LPS组小鼠NF-κB p65表达变化与模型对照组相似，两组比较差异无统计学(P>0.05)。RNAi/LPS组小鼠肝组织总蛋白NF-κB p65表达水平高于正常对照组小鼠(P<0.05)，与模型对照组比较两组间差异无统计学意义(P>0.05)；但其细胞核NF-κB p65蛋白明显低于模型对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

组别nTNF-α(pg/mL)IL-1β(pg/mL)TGF-β1(pg/mL)模型对照组造模后4h5671.63±56.1949.00±12.37153.60±18.34造模后8h51290.00±96.66122.20±15.17281.40±23.23造模后16h5550.50±69.1080.80±11.97366.00±30.50空白质粒/LPS组造模后4h8603.75±47.8957.00±13.89173.60±32.94造模后8h81185.00±99.43119.20±15.71302.20±33.97造模后16h8649.13±50.8782.80±11.43352.00±38.34RNAi/LPS组造模后4h8 482.50±53.12▲▲ 34.20±8.70▲▲ 123.40±23.76▲▲造模后8h8860.00±63.02▲▲90.00±6.16▲▲210.40±43.57▲▲造模后16h8445.00±51.27▲▲57.80±7.16▲▲239.20±26.14▲▲

与模型对照组比较，▲▲P<0.01

表4　鼠肝组织TRAF6、IL-6、COX-2 mRNA表达

与正常对照组比较，*P<0.05**P<0.01；与模型对照组比较，▲P<0.05▲▲P<0.01

A：总蛋白NF-κB p65；B：核蛋白NF-κB p65；C:β-actin图4　各组小鼠NF-κB p65蛋白表达变化Fig.4 Changes of NF-κB p65 protein expression in mice in each group

组别n总蛋白NF-κBp65/β-actin核蛋白NF-κB/β-actin正常对照组50.82±0.040.37±0.05模型对照组81.33±0.03**1.05±0.03**RNAi/LPS组81.15±0.03*0.73±0.04*▲空白质粒/LPS组81.44±0.05**1.12±0.04**

与正常对照组比较，*P<0.05**P<0.01；与模型对照组比较，▲P<0.05

3讨论

急性肝衰竭时常导致血浆内毒素水平升高，出现肠源性内毒素血症，即所谓“二次打击”。D-GalN与LPS联合应用引起肝损伤同时伴有肠源性内毒素血症的形成，但不损伤其他主要脏器，出现的肝损害表现与临床肝衰竭较相近，而且是可重复的，是一种较为理想的肝衰竭动物模型。采用D-GalN与LPS联合给药建立模型是目前学术界十分常用的方法[11-12]。因此本实验选择D-GalN与LPS联合用药制造急性肝衰竭动物模型。

流体力学注射法(hydrodynamics-based procedure)是一种快速大容量的裸质粒溶液的体内注射方法。借助该方法，目的或治疗基因可经鼠尾静脉转染动物活体器官，并在靶器官内高效表达[7]。该法具有一定的“肝靶向性”，因此特别适用于肝脏疾病相关研究。前期实验已证实，应用流体力学注射脂质体/质粒DNA复合物，目的基因可在小鼠肝脏高效表达，对肝组织病理无明显影响[8]。而且我们还发现，脂质体包裹质粒可明显提高裸质粒的转染率，但由于脂质体价格较高，动物实验需要量大的原因，在本实验中，我们应用100 μg裸质粒重复2次尾静脉注射入小鼠体内，以提高质粒转染率。本实验中，第2次pTRAF6-shRNA1转染后16 h，小鼠肝组织TRAF6 mRNA表达受到抑制，Western blot检测结果也显示，质粒转染后小鼠的肝组织TRAF6蛋白表达也明显受到抑制。

急性肝衰竭内毒素炎症反应中的关键因素是炎症因子的即时产生，特别是TNF-α。TNF-α是一种多效应的生物活性分子，在肝衰竭的发病机制中发挥重要作用。TNF-α既可以直接引起细胞损伤，也能通过激活NF-κB刺激其它促炎症介质(如IL-1β、IL-6和NO)释放扩大炎症级联反应，是内毒素血症介导组织器官损害的主要介质之一[13-14]。以往研究显示，TNF-α基因敲除小鼠或抗TNF-α抗体可完全对抗LPS产生的毒性[15]。虽然，上调这些细胞因子是机体防御细菌感染的主要机制，但其过度表达可以造成机体免疫紊乱和炎症损伤。本实验结果显示，造模后，模型对照组小鼠血清TNF-α和IL-1β浓度明显升高，于8 h达高峰，TRAF6基因沉默后小鼠TNF-α和IL-1β浓度均显著降低，8 h时，RNAi/LPS组TNF-α和IL-1β表达水平分别是模型对照组小鼠的67%和71%。Real-time PCR检测结果显示，模型对照组小鼠肝组织IL-6 mRNA表达较正常组明显增高(P<0.01)，RNAi/LPS组IL-6 mRNA表达较模型对照组明显降低(P<0.01)，可见TRAF6基因沉默对TNF-α、IL-1β和IL-6有抑制作用。

转化生长因子β1(TGF-β1)是一种重要的免疫调节性细胞因子，能抑制巨噬细胞激活，近年来，因其在组织发生、发育及损伤后修复、免疫抑制的重要作用，已成为当今研究的热点[16-17]。Dambach等[18]研究发现，NF-κB(P50)的活性丧失与TNF-α、IL-10表达下降和IL-4、TGF-β1表达增多有关，表明NF-κB能通过炎症因子和抗炎因子表达增多或减少调控肝脏炎症损伤。因此，为了证实阻断TRAF6具有对致炎和抗炎细胞因子的双重调节作用，本实验选择同时检测TGF-β1水平。研究发现，模型对照组小鼠血清TGF-β1表达水平持续增高，RNAi/LPS组小鼠血清TGF-β1浓度显著低于同时间点模型组(P<0.01)。16 h时RNAi/LPS组TGF-β1表达水平是模型组的64%。结果表明，动物体内TRAF6基因沉默不仅能抑制促炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)增长，也能抑制抗炎症细胞因子(TGF-β1)的分泌。

环加氧酶-2(COX-2)又称前列腺素过氧化物合成酶(prosta glandin hyperoxide synthase，PGHS)，是一种诱导型表达蛋白，被认为是“快速反应基因”，在生理状态下存在于细胞内，多数组织内检测不到，在细胞受到炎症刺激物质如细菌脂多糖或细胞因子如IL-1等刺激后则大量产生，因此，COX-2是病理状态下过度炎症反应的诱导酶类，与炎症程度相关，在炎症发展中具有重要作用[19]。本实验研究结果显示，模型组小鼠肝组织COX-2 mRNA表达较正常组明显增高，RNAi/LPS组COX-2 mRNA表达较模型组明显降低(P<0.05)，表明TRAF6基因沉默可明显抑制急性肝衰竭小鼠肝组织COX-2 mRNA表达。

NF-κB是二聚体形式的核转录因子，在细胞质中NF-κB与其抑制蛋白IκB-α结合，呈无活性状态，TNF-α等刺激后，经过细胞内复杂的信号转导途径，激活IKK-α、IKK-β，引起NF-κB向核内移位，激活相应的靶基因，诱导多种细胞因子(如IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α)、粘附分子、趋化因子(如IL-8、补体C3)、免疫识别受体和急性期反应蛋白的基因表达，正反馈放大炎症反应[20-24]。本实验结果证实，pTRAF6-shRNA1可有效地控制急性肝衰竭模型炎症反应，减轻肝组织总蛋白和核蛋白内NF-κB p65表达，并能明显抑制NF-κB核转位，说明pTRAF6-shRNA1可能通过下调NF-κB p65水平，抑制NF-κB p65核转位，抑制炎症相关细胞因子和炎性介质表达水平，从而减轻内毒素/半乳糖诱导的小鼠急性肝损伤，同时提示在急性肝衰竭内毒素炎症中应用RNA干扰技术体内转染干预治疗是可行的。

我们的实验由于时间和经费的限制，仅从内毒素炎症的控制角度观察了RNAi干扰后TRAF6下游炎症因子及NF-κB的表达，并未能观察TRAF6基因沉默后，有关急性肝衰竭小鼠肝组织超微结构、细胞凋亡及其对肝细胞再生的影响，这将是我们今后进一步研究的方向。

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(2015-12-03收稿)

Effect of Silencing TRAF6 Gene Expression with shRNA on Inflammatory Response in Mice with Acute Liver Injury

Chen Feng1，Zhang Furong1△，He Shengsong2etal

1IntensiveCareUnit，WuhanMedicalandHealthcareCenterforWomenandChildren，Wuhan430016，China2DepartmentofInfectiousDiseases，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo examine the effect of silencing tumor necrosis factor(TNF)receptor-associated factor-6(TRAF6)on the inflammatory responses in mice with lipopolysaccharide(LPS)/D-galactosamine(GalN)-induced acute liver failure(ALF).MethodsThe small interfering RNA(siRNA)sequence that could most effectively target TRAF6 was screened out in vitro. The plasmid pTRAF6-shRNA was delivered into BALB/c mice by hydrodynamics-based gene transfection(HGT)twice at an interval of 24 h.Twenty-four h after the second HGT，LPS/D-GalN was intraperitoneally administrated to BALB/c mice to establish the endotoxin-induced inflammatory model of acute liver failure.Animals were divided into four groups：normal control group，model control group，blank plasmid/LPS group and RNAi/LPS group.Blood samples were collected at 4，8 and 16 h after LPS/D-GalN injection.HE staining was used to observe the pathological changes of liver tissues.Meanwhile，TRAF6，interleukin-6(IL-6)and cyclooxygenease(COX)-2 mRNA levels were detected by real-time PCR.Inflammatory cytokines[TNF-α，IL-1β，transforming growth factor(TGF)-β1 and IL-6]were measured by ELISA.Western blot analysis was used to detect TRAF6 and NF-κB p65 expression in the nuclear extracts of hepatocytes.ResultsOur results showed that TRAF6 mRNA and protein expressions were remarkably reduced by 60.13% and 52.08%，respectively，in the mouse liver(P<0.01).ELISA indicated that the secretions of TNF-α，IL-1β and TGF-β1 were markedly increased after LPS/D-GalN injection，with TNF-α，IL-1β peaking at 8 h，and TGF-β1 at 16 h.Furthermore，the levels of TNF-α，IL-1β and TGF-β1 were lower in RNAi/LPS group than in model control group at different detection time points.Real-time PCR showed that IL-6，COX-2 and TRAF6 mRNA levels were obviously lower in RNAi/LPS group than in model control group(P<0.01).Moreover，total NF-κB p65 protein levels were effectively increased in RNAi/LPS group as compared with normal control group(P<0.05).However，NF-κB p65 levels in the nuclear extracts in RNAi/LPS group were significantly lower those in model control group(P<0.05).ConclusionApplication of pTRAF6-shRNA can successfully alleviate LPS/D-GalN-induced acute liver injury in vivo by inhibiting NF-κB activities and decreasing the expression of inflammatory cytokines and inflammatory mediators.

Key wordsTRAF6；RNA interference(RNAi)；TLR4 signaling；NF-κB；acute liver failure

中图分类号：R657.3

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.008

陈锋，女，1978年生，医学博士，E-mail：jmnba@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：792523496@qq.com