环氧合酶-2抑制剂NS398对食管癌细胞迁移的抑制作用及其机制*

文　卉，　刘　涛，　余宗涛，　李胜保

湖北医药学院附属太和医院消化内科，十堰　442000

环氧合酶-2抑制剂NS398对食管癌细胞迁移的抑制作用及其机制*

文卉，刘涛，余宗涛，李胜保△

湖北医药学院附属太和医院消化内科，十堰442000

摘要：目的探讨COX-2选择性抑制剂NS398对食管癌细胞株EC109迁移能力的影响及其可能机制。方法选用食管癌细胞株EC109为靶细胞，分别加入不同浓度(0、50、100 μmol/L)的NS398，利用细胞划痕实验，观测细胞48 h内迁移能力变化；采用逆转录PCR方法检测目标基因COX-2、RhoA、CDC42及Rac-1的表达变化。结果细胞划痕实验显示，50 μmol/L NS398组迁移距离[24 h：(50.81±8.51)μm，48 h：(109.67±18.38)μm]及100 μmol/L NS398组迁移距离[24 h：(53.15±9.58)μm，48 h：(97.42±13.20)μm]与对照0 μmol/L NS398组迁移距离[24 h：(68.72±5.68)μm，48 h：(129.68±10.79)μm]相比均明显减少(均P<0.05)，说明加入NS398后细胞迁移能力下降。50 μmol/L NS398组及100 μmol/L NS398组与对照0 μmol/L NS398组相比，COX-2、RhoA、CDC42、Rac-1表达均降低(均P<0.05)。结论NS398可抑制食管癌细胞EC109迁移运动能力，其机制可能与抑制COX-2表达，调节迁移基因RhoA、CDC42及Rac-1的表达有关。

关键词：环氧合酶抑制剂；食管癌；RhoA/CDC42/Rac-1信号通路；细胞迁移

食管癌是我国最常见的一种恶性肿瘤，我国食管癌的发病率为世界之首，而死亡率位居我国恶性肿瘤的第2位。食管癌早期转移是病情进展恶化的主要原因，也是食管癌复发的重要机制。研究食管癌早期转移的分子机制，探索抑制食管癌侵袭的方法是目前食管癌研究热点。

环氧合酶-2(cyclooxygenase 2，COX-2)是生成前列腺素的关键酶，是一种诱导性酶，在生理状态下几乎不或甚少表达，主要在巨噬细胞、单核细胞和滑膜细胞中表达，是肌体对组织缺氧和损伤的反应[1]。在多种肿瘤中普遍存在COX-2过度表达现象，而COX-2的过度表达与肿瘤发生、发展关系密切，抑制COX-2可降低肿瘤的发生、发展，COX-2的表达与肿瘤的预后呈负性相关关系[2]。研究显示，在食管癌中存在COX-2高表达现象，并且其高表达增加食管癌浸润、淋巴结转移的危险性[3]。NS398是COX-2选择性抑制剂，具有抑制食管癌细胞增殖，诱导食管癌细胞发生凋亡及放射增敏作用[4-6]。本课题拟研究选择性COX-2抑制剂NS398对体外培养的人食管癌细胞迁移能力的影响，并探讨其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1主要实验材料

1.1.1细胞食管癌EC109细胞系购自无锡菩禾生物医药技术有限公司，培养条件为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.1.2试剂NS398(英国Cayman公司)，以二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma)溶解NS398粉剂，配成80 mmol/L的储存液，保存于-20℃冰箱中，临用时用培养液稀释到所需浓度，DMSO最终浓度<0.2%。DMEM高糖培养液及胎牛血清均购自Gibco公司。丝裂霉素C(瑞士Roche公司)以PBS溶解。Trizol购自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购自Promega公司，PCRmix购自上海莱枫生物科技有限公司，所有引物合成由北京赛百盛基因技术有限公司完成。

1.2实验方法

1.2.1细胞划痕实验取对数生长期细胞EC109以5×105/孔的密度接种于6孔板中，待细胞长至90%～95%融合时，加入含有丝裂霉素C(浓度为25 μmol/L)培养液于37℃、5%CO2培养箱中培养1 h。取出6孔板，弃去培养液，用无菌枪头在孔板内划出空白条带，PBS洗去漂浮细胞碎片，加入含有不同浓度(0、50、100 μmol/L)NS398的培养液，放入37℃、5%CO2培养箱中培养，每浓度重复6孔，每孔一个观测点，在0、24、48 h时于镜下观测并拍摄观测点划痕变化。Image J软件检测观测点固定长度划痕面积，并除以固定长度得出平均宽度变化。

1.2.2COX-2、RhoA、CDC42及Rac-1基因mRNA表达检测取对数生长期细胞EC109以5×105/孔的密度接种于6孔板中，待细胞长至60%～75%融合时，加入含有不同浓度(0、50、100 μmol/L)NS398的培养液，培养24 h，收获细胞以Trizol法提取RNA，定量后取2 μg RNA按照RT-PCR试剂盒说明逆转录合成cDNA。反应体系：cDNA 1 μL，PCRmix 5 μL，引物各1 μL，ddH2O 2 μL；反应条件：95℃预变性5 min；95℃30 s，不同退火温度(COX-2为58℃，RhoA为55℃，CDC42为55℃，Rac-1为49℃，内参GADPH为55℃)60 s，72℃30 s，共35个循环；72℃延伸7 min。取5 μL PCR产物加入2 μL上样缓冲液，于质量分数2%琼脂糖凝胶上电泳。Image J软件检测琼脂糖电泳条带灰度值，以目的条带与内参条带GAPDH灰度值的比值为目的mRNA表达的相对值，实验每组重复4次。

1.3统计学分析

2结果

2.1细胞划痕实验检测NS398对食管癌细胞EC109迁移能力的影响

本实验运用丝裂霉素C抑制细胞增殖以排除细胞增殖对结果的影响。不同浓度(0、50、100 μmol/L)NS398对EC109细胞作用24、48 h后，测得50 μmol/L NS398组迁移距离为24 h(50.81±8.51)μm，48 h(109.67±18.38)μm，100 μmol/L NS398组迁移距离24 h(53.15±9.58)μm，48 h(97.42±13.20)μm，均明显小于对照0 μmol/L NS398组迁移距离24 h(68.72±5.68)μm，48 h(129.68±10.79)μm，均P<0.05，见图1。

2.2NS398抑制食管癌EC109细胞的COX-2 mRNA表达

运用不同浓度(0、50、100 μmol/L)NS398对EC109细胞作用24 h后，提取RNA行逆转录PCR，检测COX-2基因mRNA表达，结果如图2所示，50 μmol/L NS398组及100 μmol/L NS398组与对照0 μmol/L NS398组相比，COX-2 mRNA表达均降低(均P<0.05)，表明NS398能够抑制COX-2 mRNA表达。

2.3NS398抑制食管癌EC109细胞的RhoA、CDC42及Rac-1基因mRNA表达

不同浓度(0、50、100 μmol/L)NS398对EC109细胞作用24 h后，提取RNA行逆转录PCR，检测RhoA、CDC42及Rac-1基因mRNA表达，结果如图2所示，50 μmol/L NS398组及100 μmol/L NS398组与对照0 μmol/L NS398组相比，RhoA、CDC42、Rac-1的mRNA表达均降低(均P<0.05)。表明NS398能够抑制RhoA、CDC42及Rac-1的mRNA表达。

3讨论

食管癌早期症状隐匿，具有侵袭性强，容易局部浸润并累及淋巴结，且从淋巴结和血源进行广泛转移的行为特点，故患者术后生存率较低、预后差。食管癌的早期侵袭转移是绝大多数患者的致死因素[7]。食管癌细胞从原发灶脱离，移动性增加，侵入周围组织、淋巴管及血管，到达远处器官后粘附定植形成转移灶，这一系列过程中，每一个环节都影响了食管癌侵袭转移能力，有多种炎性介质及信号通路参与。

与对照(0 μmol/L NS398)组比较，*P<0.05图1　NS398对食管癌EC109细胞迁移能力的影响Fig.1 Effect of NS398 on the migrating ability of EC109 cells

与对照(0 μmol/L NS398)组比较，*P<0.05图2　NS398对食管癌细胞EC109中COX-2、RhoA、CDC42、Rac-1表达的影响Fig.2 Effect of NS398 on the expression of COX-2，RhoA，CDC42 and Rac-1 in EC109 cells

前列腺素是重要的信号因子，参与细胞粘附、增殖和分化等功能，在肿瘤的发生发展中具有重要作用。其参与肿瘤间质血管的形成，诱导活化前致癌物，促进肿瘤细胞增殖，调节细胞周期，抑制细胞凋亡，增加肿瘤细胞的浸润性和转移性，并通过降低自然杀伤细胞的活性来逃避免疫监视[2]。COX-2是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，是调节前列腺素表达的关键因素，但COX-2如何调控肿瘤细胞迁移、侵袭能力目前尚不明确。我们用COX-2选择性抑制剂NS398处理食管癌EC109细胞后，RT-PCR检测结果显示COX-2 mRNA表达下降，说明NS398能够抑制COX-2 mRNA表达。细胞划痕实验检测结果显示NS398处理后食管癌细胞迁移能力下降，说明NS398能够抑制食管癌细胞的迁移能力，其抑制作用可能与COX-2表达降低相关。

COX-2是通过何种下游分子来促进食管癌细胞的迁移能力？COX-2选择性抑制剂NS398通过哪些通路来调节食管癌细胞的迁移及运动能力，目前仍不清楚。我们用NS398处理食管癌EC109细胞后，采用RT-PCR检测到RhoA、CDC42及Rac-1的mRNA表达降低。Rho、Rac-1和CDC42等共同组成RHO蛋白家族，RHO蛋白家族是RAS超家族的中小分子量的G蛋白，是细胞的信号传导通路中的重要信号转换因子，参与应力纤维装配和黏着斑形成的调控，与细胞粘附、迁移、增殖及凋亡等多种能力相关。其中RhoA与GTP结合后活化进而刺激下游因子，调节肌动蛋白的聚合及肌动蛋白、肌球蛋白的收缩，从而引起细胞迁移。RhoA蛋白具有调节迁移过程中产生细胞突起，形成新附着生长及稳定现有附着物生长的作用。CDC42蛋白诱导肿瘤细胞形成迁移的前沿肌动蛋白丝状伪足，促进肌动蛋白聚合，导致富含肌动蛋白的突起或伪足形成，并进一步参与丝状伪足与细胞外基质的粘附。Rac1可通过与胰岛素受体酪氨酸激酶p53(insulin receptor tyrosine kinase substrate p53，IRSp53)结合，然后IRSp53与WAVE2-Abi1结合，形成Rac1-IRSp53-WAVE2-Abi1复合体刺激Arp2/3，调节集落刺激因子-1诱导的前端伪足形成。RhoA和Rac1还可以通过调节基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和其金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)的水平来调节胞外基质的降解和重建[8]。由此可见RhoA、CDC42及Rac-1蛋白能够诱导并促进肿瘤细胞迁移运动。本研究结果显示NS398能够抑制COX-2的表达，并通过降低RhoA、CDC42及Rac-1的表达来抑制食管癌EC109细胞的迁移能力。

既往研究显示，COX-2可以增强肿瘤的侵袭力，主要通过激活MMPs，增加CD44表达，并降低细胞粘附因子上皮钙粘素(E-cadherin)表达来实现。而MMP是肿瘤细胞转移和基底膜胶原蛋白消化中非常重要的酶，E-cadherin表达降低促进肿瘤细胞从原发灶脱离，促进细胞分裂，降低细胞分化[7]，既往研究从细胞侵袭能力改变揭示了COX-2促进食管癌转移的可能机制。本研究则从细胞迁移运动能力改变进一步说明了COX-2促进食管癌转移的可能机制。但食管癌细胞的迁移、侵袭是一个非常复杂的过程，涉及到多种信号通路的相互联系和作用，NS398如何调控RHO蛋白的表达，是否还有其他信号通路参与COX-2调控细胞迁移能力的过程，仍需进一步研究和探索。

参考文献

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(2015-08-27收稿)

Inhibitory Effect of the COX-2 Selective Inhibitor NS398 on the Migration of Esophageal Carcinoma Cells

Wen Hui，Liu Tao，Yu Zongtaoetal

DepartmentofGastroenterology，TaiheHospital，HubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000，China

AbstractObjectiveTo investigate the effect of NS398，a COX-2 selective inhibitor，on the migration of EC109 cells(an esophageal carcinoma cell line)and the underlying mechanism.MethodsEC109 cells were treated with NS398 at different concentrations(0，50，100 μmol/L).Cell wound-healing assay was used to observe the changes of cell migration within 48 h after treatment，and reverse transcription polymerase chain reaction(PCR)to detect the expression levels of COX-2，RhoA，CDC42 and Rac-1.ResultsThe cell wound-healing assay showed that the migration distance was much less in 50 μmol/L[24 h：(50.81±8.51)μm，48 h：(109.67±18.38)μm]and 100 μmol/L[24 h：(53.15±9.58)μm，48 h：(97.42±13.20)μm]NS398 groups than in 0 μmol/L NS398 group[24 h：(68.72±5.68)μm，48 h：(129.68±10.79)μm](P<0.05)，suggesting the decline of the migrating ability of EC109 cells treated with NS398.The expression levels of COX-2，RhoA，CDC42 and Rac-1 were significantly decreased in 50 μmol/L and 100 μmol/L NS398 groups when compared with 0 μmol/L NS398 group(P<0.05).ConclusionNS398 inhibits the migration of EC109 esophageal carcinoma cells by inhibiting the COX-2 expression and regulating the expression of migration-related genes RhoA，CDC42 and Rac-1.

Key wordscyclooxygenase inhibitor；esophageal carcinoma；RhoA/CDC42/Rac-1 signal pathway；cell migration

中图分类号：R735.1

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.013

*湖北省自然科学基金资助项目(No.2011CDC050)

文卉，女，1987年生，医学硕士，住院医师，E-mail：iriswenhui@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：libao999@163.com