羊传染性脓疱皮炎弱毒苗耐热保护剂初步优化筛选试验研究

冯玲霞，张述斌，蒙琦，张海明

（1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉744000；2.甘肃省华亭县动物疫病预防控制中心，744100）

羊传染性脓疱皮炎弱毒苗耐热保护剂初步优化筛选试验研究

冯玲霞1，张述斌1，蒙琦1，张海明2

（1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉744000；2.甘肃省华亭县动物疫病预防控制中心，744100）

试验以羊传染性脓疱皮炎弱毒活疫苗为对象,依据冻干保护剂的保护功能，对耐热保护剂的组成、混合比例进行了初步筛选。通过反复试验，对其物理性状观察、水分含量测定、冻干前后病毒损失量、经37℃处理、25℃保存后病毒损失量等指标的比较进行筛选，优选出了符合要求的A3、A6、C4三个耐热保护剂配方。试验结果表明，使用保护剂的羊口疮疫苗在37℃保存20 d，病毒含量下降0.5～0.7个滴度，常规疫苗下降2.3个滴度；25℃保存60d，病毒含量下降0.3～0.6个滴度，常规疫苗下降2.5个滴度。从而证明了羊orf耐热活疫苗耐热效果优于常规疫苗。

羊传染性脓疱皮炎；弱毒苗；耐热保护剂；筛选试验

羊传染性脓疱皮炎（orf）,俗称羊口疮，是危害绵、山羊的一种急性、接触性的高度传染病，其中以羔羊最易患本病，一旦发生，传染非常迅速，隔离治疗法往往收不到理想效果，故最好施行疫苗接种，但传统的活疫苗热稳定性和保护功能差，对冷链的要求高，2～8℃条件下，保存期只有3～6个月，大多需在-15℃以下保存，这给疫苗的储存和运输带来很大困难，容易因免疫失败而造成疫病的流行。为了加快新型有效的耐热保护剂的研究和应用，本研究以羊传染性脓疱皮炎弱毒活疫苗为对象，根据冻干保护剂的种类和作用机制，主要筛选了聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、乳糖、蔗糖、多聚蛋白胨、谷氨酸钠、维生素C等物质作为保护剂的主要成分。采用单因子试验对耐热保护剂的组成和配方比例进行筛选，并将其应用于羊传染性脓疱皮炎弱毒活疫苗的试制生产中，经反复试验，证明其对羊orf病毒具有良好的耐热保护功能。这对提高羊orf疫苗的质量，控制羊orf病的发生与流行具有重大意义。

1 试验材料

1.1 试验用毒株

生产疫苗的HCE种毒 （即82代羊orf弱毒株）由甘肃省畜牧兽医研究所鉴定、保管和供应。

1.2 试验用细胞

犊牛睾丸细胞由“羊传染性脓疱皮炎(orf)耐热性活疫苗的研究”项目组制备。

1.3 试验仪器

CO2培养箱、AD—1型单细胞旋转培养机、真空冷冻干燥机、Mettler Toledo DL31水分测定仪、真空测定器、高压蒸汽灭菌器、精密电子天平、生化培养箱、超净工作台、普通离心机、磁力搅拌器、移液器、干燥箱等。

1.4 实验药品及试剂

1.4.1 病毒冻干保护剂：蔗糖、乳糖、脱脂奶粉、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸钠、多聚蛋白胨、维生素C。

1.4.2 其它化学试剂：199培养基、水解乳蛋白、胰蛋白酶等。

2 试验方法

2.1 抗原液的制备

取82代羊orf弱毒株（生产用种毒），经生长良好的犊牛睾丸细胞传代培养至85代后，测定其毒价，7～9d内该种毒TCID50≥106/0.1mL以上；其它按《中华人民共和国兽用生物制品制造及检验规程》方法进行检测合格后，在-15℃冰箱冻存备用。

2.2 耐热保护剂的配制

根据冻干活疫苗的质量要求和各类型原材料的作用机理，将聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、乳糖、蔗糖、多聚蛋白胨、谷氨酸钠、维生素C、磷酸二氢钾、磷酸氢钠等几类物质按照不同的物质和不同的量组合成An、Bn、Cn多个配方进行耐热保护剂的初步筛选。

将保护剂按组份、比例混合，分别进行除菌处理：(1）对可高压灭菌的聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、蔗糖、多聚蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢钠，按各自比例溶于蒸馏水中，116℃灭菌 30～40min；（2）将不耐高温的物质组份山梨醇、谷氨酸钠、维生素C，均按各自比例溶于蒸馏水中，用孔径0.22μm滤膜过滤除菌；（3）犊牛血清，用孔径0.22μm 滤膜过滤除菌。 再将（1）、（2）、（3）三种成分按比例混合，即为冻干耐热保护剂。使用时按1∶2比例加入病毒抗原液中，分装后进行冷冻干燥。

2.3 耐热冻干保护剂的初步筛选试验

取orf弱毒株病毒液与不同组方的保护剂，按2:1比例混合，定量分装，以传统的保护剂配方作对照，在同一冻干箱用同一冻干曲线进行分批冻干。通过其物理性状、水分含量、冻干前后病毒损失、经37℃处理15d、30d后病毒损失等指标的比较进行初步筛选。筛选的标准是冻干前后病毒损失小、具有一定的耐热性，且物理性状、水份含量合格。

2.4 耐热冻干保护剂的优化筛选

在初步筛选的基础上，将测定结果均达到试验设计要求的配方及配比组成（A3、A6、A8；B2、B3、B6；C1、C4、C7），在同一个冻干箱用同一冻干曲线再次进行冻干，并用常规保护剂疫苗作对照，取冻干样品进行检测。通过冻干前后病毒的损失量、37℃处理10d、20d及25℃放置 30d和60d后病毒损失量的比较进行二次筛选。

2.4.1 耐热冻干保护剂疫苗冻干效果检验:按现行《中华人民共和国兽用生物制品制造及检验规程》方法检测其物理性状、真空度和剩余水份，评价耐热冻干保护剂疫苗冻干效果。

2.4.2 热稳定性试验：冻干后取样分别经37℃处理10d、20d，25℃放置 30d和60d，并与传统的活疫苗进行比较，用微量法对样品进行ECID50测定。以其病毒滴度无明显下降，损失量较小，不影响使用效果为标准进行优选。

3 试验结果

3.1 耐热保护剂初步筛选结果

依据冷冻干燥效果观察、冻干前后病毒损失量、37℃处理15d、30d后病毒损失量等指标的比较，对试验结果进行对比分析（略），最终获得比较理想的耐热保护剂组方分别为A3、A6、A8；B2、B3、B6；C1、C4、C7。

3.2 耐热冻干保护剂的优化筛选试验结果

3.2.1 物理性状、剩余水分测定结果:产品冻干后，对其物理性状进行观察，样品分别为乳白色、微黄色海绵状疏松团块，表面有微小孔隙，摇晃后可与瓶壁脱落，加稀释液后可迅速溶解；并对其真空度和剩余水分进行了测定，结果见下表。

表：物理性状、剩余水份及真空度测定结果

3.2.2 冻干前后：37℃处理 10d、20d；25 ℃放置30d、60d后病毒损失量测定结果分别见图1、图2。

图1 耐热保护剂冻干苗经37℃处理后病毒损失量比较

图2 耐热保护剂冻干苗经25℃处理后病毒损失量比较

结果表明，冻干前后各个组病毒损失量较小，无明显差异；37℃处理10 d、20 d后，A3、A6和C4配方组的ECID50下降不超过0.7个滴度。25℃放置 30d、60d 后，A3、A6 和 C4 配方组的ECID50下降幅度较小且不超过0.6个滴度，其他组别下降幅度较大，普通疫苗组分别下降2.2和2.5个滴度。通过上述试验，最终获得比较理想的耐热保护剂，分别为A3、A6和C4。

4 小结与讨论

在筛选耐热保护剂配方时，大分子和小分子物质配合使用十分重要。大分子物质构成冻干制品多孔构架，小分子物质主要作用是防止蛋白质变性，防止干燥状态下微生物的氧化，大分子物质与小分子物质配合使用，能有效地增强小分子的保护作用。试验结果表明，耐热保护剂疫苗冻型、色泽、质地良好，水分含量低，真空度合格，冻干前后病毒损失少，说明我们所选择的保护剂配方搭配合理，具有更好的保护作用。

通过耐热性试验，常规保护剂疫苗病毒损失迅速发生，说明常规疫苗用蔗糖脱脂奶保护剂在高温条件下的耐热性能差。A3、A6、C4保护剂疫苗在37℃耐老化试验和常温保存中病毒损失量小，说明我们筛选出的耐热保护剂在疫苗的生产和保存过程中均表现出了稳定的耐热性能，且具有良好的耐热效果。

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1003-8655（2016）05-0018-03