阿尔茨海默病的秀丽隐杆线虫模型及中医药干预应用进展

李　琼，迟惠英，陈　川

阿尔茨海默病的秀丽隐杆线虫模型及中医药干预应用进展

李琼，迟惠英，陈川

上海市中医老年医学研究所(上海 20031)

摘要：阿尔茨海默病是最常见的神经退行性病变，其发病机制尚不清楚。秀丽隐杆线虫具有导致阿尔茨海默病发病的同源基因等优势被应用于阿尔茨海默病机制的研究中。本研究综述与阿尔茨海默病有关的秀丽隐杆转基因线虫模型，并对中医药干预其作用及机制进行总结。

关键词：阿尔茨海默病；秀丽隐杆线虫；转基因模型；中医药

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种与老化相关的神经退行性疾病，其发病机制尚不清楚。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C．elegans) 是研究与衰老相关疾病的良好模型，因其具有导致AD发病的同源基因等特点被应用于AD机制的研究。

1秀丽隐杆线虫的概述

Sydney Brenner于1963年首次提出将线虫作为研究发育生物学和神经生物学理想的模式生物[1]。其作为模式生物的优点为： ①身长短，养约1 mm，以大肠杆菌为食，易于饲养；②虫体全身呈透明状，便于荧光显微镜对任一细胞进行观察；③生命周期短。在实验室20 ℃的环境下，从卵发育到成虫3 d，平均寿命为3周。④繁殖快并且多产。一只雌雄同体线虫可以产下300多个后代，经雄虫交配后可以产下1 000多个后代。⑤具有与人类保守性高的神经系统。线虫雌雄同体成虫有959个体细胞，雄虫成虫有1 031个体细胞[2]，由302个和391个神经元组成雌雄同体成虫和雄虫的神经系统。其神经元细胞占其体细胞的37%以上。神经元的结构简单，只有一个或两个不分叉的突起，形成或接受突触连结，但其基本功能与其他哺乳动物相似，并包含多种经典的和其他哺乳动物类似的神经递质；如：乙酰胆碱、五羟色胺、多巴胺、谷氨酞胺，氨基丁酸和神经肽等。这些神经递质在神经元中的合成、储存和代谢等过程都与哺乳动物具有高度相似性。⑥具有复杂的行为学特征，包括机械感知和化学感知，趋化性及趋温性。⑦生命力顽强，可以在-80 ℃条件下长期冻存，需要时可随时复苏。⑧拥有专业线虫网站，可提供查找购买各种线虫突变品系(http：//www．wormbase．org/)。

2阿尔茨海默病的秀丽隐杆线虫模型

秀丽隐杆线虫基因测序已完成，有60%～80%的基因和人类同源，比如APP、 Tau 基因[3-4]。目前，认为APP、PS1、PS2、Tau、ApoE4基因与早发的家族遗传型AD的发病有密切关系[5-9]。除ApoE4在C．elegans中未找到同源基因外，其余基因对应同源基因分别为apl-1、sel-12、hop-1、ptl-1[10-13]。为了研究AD发病机制，细胞培养模型及啮齿类动物模型被广泛应用。用PC12细胞进行AD建模，该细胞与人类神经细胞结构、分泌及功能存在有一定的差异；且多选用Aβ(25～35)片断添加于细胞培养液中制备细胞模型，这与老年斑(senile plaques，SP)中主要组分Aβ40、Aβ42氨基酸片断也有差别，建立的模型并不能完善地呈现AD疾病的发生发展，会限制其进一步研究[14]。啮齿类转基因鼠主要有表达APP基因或双转基因PS和APP，这些模型是成功的复制了AD的病变特征[15-18]。双转基因动物具有难以培育、容易死亡、价格较为昂贵，成模周期较长的不[19-20]。

线虫成本低，易于饲养，模型稳定，其与人类保守性高，具有AD发病的同源基因，且便于判断药物治疗AD有无效果(通过观察线虫麻痹率有无改善)。使得其为探究AD的机制及筛选相关治疗药物打开了新思路。目前，在线虫中建立的转基因模型主要有Aβ模型和Tau模型[21]。

2．1 Aβ模型AD是以脑细胞外沉积的老年斑及细胞内形成的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)[22]为主要病理改变的神经退行性疾病。淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉积是SP的核心，其由APP经β-分泌酶和γ-分泌酶水解而来。C．elegans体内APP同源的基因是apl-1，APL-1蛋白缺乏Aβ肽而且没有类似的β-分泌酶[12]。1995年，Link[23]首次在肌肉细胞中建立了由特异性启动子unc-54控制Aβ表达的转基因线虫模型。该模型(CL2006)能够在细胞内产生人源性的Aβ1-42沉积以及出现机体进行性的麻痹表型，主要用于Aβ毒性和淀粉质形成机制的研究。为了进一步研究Aβ肽完整长度的影响，Fay等[24]用Aβ肽第35位上的Cys替换Met，妨碍了淀粉质的形成，这个结果暗示了蛋氨基酸在淀粉质的形成过程起着重要作用。

Link等[25]在幼虫体内建立了上调温度后其肌肉细胞表达Aβ1-42的转基因模型CL4176。CL4176在16℃下是正常的运动表现，温度上调到25℃导致了线虫麻痹的发生[26]。该模型可消除由线虫衰老造成麻痹的影响。CL2006和CL4176模型Aβ的表达被限制在肌肉细胞中，但仍然部分解释了Aβ表达和Aβ的毒性的关系[27]。理论上，在神经细胞过表达毒性Aβ的模型更接近AD。

Wu等[28]在神经细胞中建立了表达Aβ1-42转基因模型CL2355。该模型表型的缺点是在趋药性的行为和5-羟色胺敏感性方面的表现不足，是可用来研究Aβ毒性和神经功能之间关系的模型。Treusch等[29]建立了在谷氨酰胺神经元细胞中表达Aβ的模型。该模型目前没有表型，但通过该模型发现，细胞骨架相关的基因(YAP1802，INP52，SLA1，CRM1，GRR1，KEM1，RTS1)参与了神经退行性病变的调节。eat-4在谷氨酰胺神经元中特异性表达，将Peat-4：GFP载体转入线虫获得转基因线虫，谷氨酰胺神经元被GFP标记，该模型证明了谷氨酰胺神经元细胞的丢失量与衰老成正相关关系。Goedert等[30]在神经细胞中建立了表达 Aβ1～40A2V的转基因模型，该模型缩短了线虫的寿命，引起了行为的缺陷和神经递质的损伤，对研究突触体机能障碍及AβN-末端变异引起的Aβ寡聚体形成增多机制打开了新思路。Aβ在CL2006、CL4176和CL2355模型中的分布位置详见图1。

图1具体内容介绍：Anterior regions of transgenic C．

elegans worms fixed and probed for Aβ．Top panel:

CL2006 adult probed with anti-AβmAb 4G8．

Middle panel:CL4176 3rd stage larvae probed with

anti-Aβ mAb 6E10．Bottom panel: CL2355

adult probed with anti-Aβ mAb 6E10.

Images are overlays of DIC brightfield image

and digitally deconvoluted epifluorescence images．

Size bar=50 mM

摘自：Lublinl AL, Link CDal．Alzheimer’s

disease drug discovery:in vivo screening using

Caenorhabditis elegans as a model for b-

amyloid peptide-induced toxicity[J]．

Drug Discovery Today,2013,1:e116-e119.

图1Aβ在CL2006、CL4176和CL2355模型中的分布位置

2．2Tau模型Tau蛋白过度磷酸化异常聚集形成NFTs，其对AD病理过程发生有重要作用。Kraemer等[31]建立了在神经细胞特异性表达野生型和FTDP(frontotemporal dementia with parkinsonism chromosome，FTDP)突变型(P301L和v337M )的Tau转基因模型，发现野生和突变Tau过表达都会出现运动不协调(uncoordinated movement，UNC) 的表型，UNC会随着衰老而渐进性加重。而且观察到以磷酸化形式沉积的Tau，并且电镜下可见轴突扩张，呈不规则的空泡状。以此模型为基础，Kraemer等[32]研究sut-1基因和Tau引起的神经毒性的关系。抑制sut-1(编码RNA和snRNP-相关蛋白的基因)则减轻突变Tau模型引起的神经毒性并且UNC得到改善。Sut-1没有在人类中发现同源基因。Guthrie等[33]发现sut-2(编码CCCH型锌指蛋白亚型的基因)存在于从酵母到人类的所有物种中。sut-2的功能抑制减少了V337M Tau转基因突变型Tau的聚合并能够减缓神经退行性病变的发生。sut基因家族抑制Tau引起的神经毒性。后续的研究发现MSUT-2是sut-2基因的人类同源基因，在哺乳动物细胞培养模型中将其敲除，则可改善由Tau引起的病理改变[34]。

Chronis等[35]建立了将v337M突变Tau和F3△K280Tau片断结合的Tau转基因模型，该模型表现了Tau的加速聚集和Tau引起的严重神经毒性，从而导致了严重受损的运动性和神经功能障碍的出现。通过建立这个模型，可以证明抑制Tau的聚集可以达到神经保护的作用。Tomohiro等[36]建立了在感觉神经元特异性表达野生型和FTDP突变型(P301L和R406W) Tau的转基因模型，在感觉神经元中Tau高表达，导致感觉运动神经元功能下降。生命周期过程中野生型比突变型对感觉刺激的反应要灵敏。突变Tau模型表现出异常的神经炎症及微管的变薄、弯曲、丢失。是目前已有的基于线虫建立的Aβ模型和Tau模型(见图2)。

图2　目前已有的基于线虫建立的Aβ模型和Tau模型

3关于中医药干预秀丽隐杆线虫AD模型的研究及思考

研究发现，EGb761可以延长线虫寿命和延迟麻痹的出现[37]，通过降低活性氧( reactive oxygen species，ROS)水平，减少细胞内的自由基，从而抑制Aβ42寡聚体的产生和沉积的作用[38-39]。给mev-1突变体线虫(Tk22)给予EGb761，其抗氧化能力和热应激能力分别提高33%和11%。说明EGb761可以通过增强抗氧化能力从而抑制Aβ沉积及减轻Aβ引起的神经毒性。hsp-16基因在表达Aβ的转基因线虫中表达升高[40]，将hsp-16基因用GFP标记，给该转基因线虫(TJ375)模型给予EGb761后，hsp-16的表达被抑制[41]。六味地黄丸乙醇提取物(LWDH-EE，主要成分为没食子酸和芍药苷)，干预CL4176线虫模型，LWDH-EE 通过降低线虫体内ROS的产生；减少线虫体内amy1表达来改善Aβ引起的神经毒性，其对Aβ的沉积不能发挥干预作用[42]。尽管EGb761防治 AD 的研究有一定进展，但在探讨其作用机制上仍存在不足之处，如EGb761对 Tau 蛋白在AD发病机制作用影响的研究尚处于空白。

国内外对单味中药(除EGb761外)、中药某一有效成分及传统中药复方对AD的防治作用机制的相关研究尚处于空白。 针对上述问题，应该充分发挥线虫模型的优势，应用现代生物技术，探寻中医药领域中未被发现的具有治疗AD的中药及中药复方并研究其机制，这将是未来研究工作的方向及临床运用的重点。

参考文献：

[1]Brenner S．The genetics of Caenorhabditis elegans[J]．Genetics，1974，77(1)：71-94．

[2]Sulston JE．Horvitz HR．Post-embryonic celll ineages of the nematode，Caenorhabditis elegans[J]．Dev Biol，1977，56(1)：110-156．

[3]Celegans Sequencing Consortium(1998)．Genome sequence of the nematode C．elegans： a platform for investigating biology[J]．Science，1998，282(5396)：2012-2018．

[4]Shaye DD，Greenwald I．OrthoList：a compendium of C．elegans genes with human orthologs[J]．PLoS One，2011，6(5)：e20085．

[5]Goate A，Chartier-Harlin，Mulla M，et al．Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer’s disease[J]．Nature，1991，349(6311)： 704-706．

[6]Sleegers K，Brouwers N，Ijselinck I，et al．APP duplication is sufficient to cause early onset Alzheimer’s dementia with cerebral amyloid angiopathy[J]．Brain，2006，129(Pc11)： 2977-2983．

[7]Sherrington R，Rogaev EI，Liang Y，et al．Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease[J]．Nature，1995，375(6534)：754-760．

[8]Rogaev EI，Sherrington R，Rogaeva EA，et al．Familial Alzheimer’s disease in kindreds with missense mutations in a gene on chromosome 1 related to the Alzheimer’s disease type 3 gene[J]．Nature，1995，376(6543)：775-778．

[9]Roses AD．Apolipoprotein E and Alzheimer’s disease．The tip of the susceptibility iceberg[J]．Ann N Y Acad Sci，1998，855：738-743．

[10]Daigle I，Li C．apl-1，a Caenorhabditis elegans gene encoding a protein related to the human beta-amyloid protein precursor[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(24)：12045-12049．

[11]Li X，Greenwald I．HOP-1，a Caenorhabditis elegans presenilin，appears to be functionally redundant with SEL-12 presenilin and to facilitate LIN-12 and GLP-1 signaling[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(22)：12204-12209．

[12]Westlund B，Parry D，Clover R，et al．Reverse genetic analysis of Caenorhabditis elegans presenilins reveals redundant but unequal roles for sel-12 and hop-1 in Notch-pathway signaling[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(5)：2497-2502．

[13]Goedert ML，Baur CP，Ahringer J，et al．PLT-1 a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans[J]．Cell Sci，1996 109 ( Pt 11)：2661-2672．

[14]晁宁，于会艳，秦斌．借助阿尔茨海默病细胞模型探讨氧化应激发病机[J]．中国医学前沿杂志，2012，4(10)：51-54．

[15]George-Hyslop P，Haines J，Rogaev E， et al．Genetic evidence for a novel familial Alzheimer’s disease locus on chromosome 14[J]．Nat Genet，1992，2(4)： 330-334．

[16]Sherrington R，Rogaev EI，Liang Y， et al．Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease[J]．Nature，1995，375(6543)： 754-760．

[17]Corder EH，Saunders AM，Strittmatter WJ， et al．Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families[J]．Science，1993，261(5123)： 921-923．

[18]Calhoun ME，Burgermeister P，Phinney AL，et al．Neuronal overexpression of mutant amyloid precursor protein results in prominent deposition of cerebrovascular amyloid[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(24)：14088-14093．

[19]梁琳，李浩，刘剑刚，等．中医药干预APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠研究进展[J]．中国中西医结合杂志，2013，33(9)：1292-1294．

[20]杨翠翠，李林，张兰．常用阿尔茨海默病动物模型制备方法及评价[J]．成都医学院学报，2013，8(4)：374-378．

[21]杨平．阿尔茨海默病的秀丽隐杆线虫模型及其应用[J]．中国细胞生物学学报，2010，32(1)：37-42．

[22]Selkoe DJ．Alzheimer’s disease：genes，proteins，and therapy[J]．Physiol Rev，2001，81(2)：741-766．

[23]Link CD．Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(20)：9368-9372．

[24]Fay DS，Fluet A，Johnson CJ，et al．In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants[J]．Neurochem，1998，71(4)，1616-1625．

[25]Link CD，Taft A，Duke K，et al．Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer’s disease model[J]．Neurobiol Aging，2003，24(3)：397-413．

[26]Dostal V，Link CD．Assaying beta-amyloid toxicity using a transgenic C．elegans model[J]．Vis Exp，2010，44： 2252．

[27]Drake J，Link CD，Butterfield DA．Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer’s disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model[J]．Neurobiol Aging，2003，24(3)：415-420．

[28]Wu Y，Wu Z，Butko P，et al．Amyloid- b-induced pathological behaviors are suppressed by ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis[J]．Neurosci，2006，26(50)：13102-13113．

[29]Treusch S，Hamamichi S,Matlack KE，et al．Functional Links between Ab toxicity，endocytic trafficking，and Alzheimer’s disease risk factors in yeast[J]．Science ，2011，334(6060)：1241-1215．

[30] Diomede DI，Fede G，Romeo M，et al．Expression of A2V-mutated Aβ in Caenorhabditis elegans results in oligomer formation and toxicity[J]. Neurobiol Dis，2014，62：521-532.

[31] Kraemer BC，Zhang B，Leverenz JB，et al．Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(17)：9980-9985.

[32]Kraemer BC，Schellenberg GD．SUT-1 enables tau-induced neurotoxicity in Celegans[J]．Hum Mol Genet，2007，16(16)：1959-1971．

[33]Guthrie CR，Schellenberg GD，Kraemer BC．SUT-2 potentiates tau-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans[J]．Hum Mol Genet，2009，18(10)：1825-1838．

[34]Wheeler JM，Guthrie CR，Kraemer BC．The role of MSUT-2 in tau neurotoxicity： a target for neuroprotection in tauopathy[J]．Biochem Soc Trans，2009，38(4)：973-976．

[35]Chronis F，Ghulam Ji P，Jacek B，et al．Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity[J]．Human Molecular Genetics，2012，21(16)：3587-3603．

[36]Tomohiro M，Zhen DK Gengyo A，et al．Progressive neurodegeneration in C．elegans model of tauopathy[J]．Neurobiology of Disease，2005，20(2)：372-383．

[37]Wu Y，Luo Y．Transgenic C．elegans as a model in Alzheimer’s research[J]．Curr Alzheimer Res，2005，2(1)：37-45．

[38]Smith JV，Luo Y．Elevation of oxidative free radicals in Alzheimer’s disease models can be attenuated by Ginkgo biloba extract EGb 761[J]．J Alzheimers Dis，2003，5(4)：287-300．

[39]Wu Y，Wu Z，Butko P，et al．Amyloid beta induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic caenorhabditis elegans[J]．J Neurosci，2006，26(50)：13102-13113．

[40]Fay DS，Fluet A，Johnson CJ，et al ．In vivo aggregation of beta-amyloid pepetide variants[J]．Neurochem，1998，71(4)：1616-1625．

[41]Strayer A，Wu Z，Christen Y，et al．Expression of the small heat-shock protein Hsp16-2 in Caenorhabditis elegans is suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761[J]．FASEB J，2003，17(15)：2305-2307．

[42]Sangha JS，Sun X，Wally OS，et al．Liuwei Dihuang(LWDH)，atraditional Chinese medicinal formula，protects against β-amyloid toxicity in transgenic Caenorhabditis elegans[J]．PLoS One，2012，7(8)：e43990．

(本文编辑王雅洁)

通讯作者：陈川，E-mail：ch9453@126．com．

中图分类号：R749R255

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．01．011

文章编号：1672-1349(2016)01-0038-04

(收稿日期：2015-03-01)