西藏林芝地区藏猪源大肠杆菌耐药表型及耐药基因检测

罗润波，王　刚，云旦平措，益西旺扎，贡　嘎，索朗斯珠（西藏大学农牧学院动物科学学院，西藏林芝860000）



西藏林芝地区藏猪源大肠杆菌耐药表型及耐药基因检测

罗润波，王刚，云旦平措，益西旺扎，贡嘎，索朗斯珠*
（西藏大学农牧学院动物科学学院，西藏林芝860000）

摘要：本文采集西藏林芝地区藏猪养殖场和散养藏猪腹泻物，采用细菌学方法分离鉴定藏猪源大肠杆菌后，检测抗菌药物的敏感性及耐药基因。结果显示：林芝地区藏猪源大肠杆菌分离菌株对各种抗生素存在不同程度的耐药性，其中对诺氟沙星、阿奇霉素、复方新诺明极敏感；对氯霉素、头孢唑林、链霉素、丁胺卡那霉素、四环素、庆大霉素、头孢西丁高度敏感；呋喃妥因中度敏感；而对万古霉素、青霉素、红霉素耐药。并检测出P基因，其检出率为100%。根据实验结果，提出了科学用药措施，为西藏林芝地区藏猪养殖业的健康发展提供理论依据。

关键词：大肠杆菌；藏猪；耐药性基因

1　材料与方法

1.1材料

本项目于2013年1月～2013年12月期间，以灭菌棉签蘸取采集西藏林芝地区不同藏猪养殖场及散养藏猪腹泻物，作为细菌分离病料。

1.2药品试剂

表1　大肠杆菌药敏表型及耐药基因检测药品

1.3仪器设备

表2　大肠杆菌药敏表型及耐药基因检测仪器设备

2　方法

2.1细菌分离培养

将采集的腹泻物样品无菌接种于普通琼脂培养基，而后挑去单菌落依次接种于麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基上，置37℃恒温培养箱中培养20 h，观察结果。

2.2药敏试验

吸取分离后细菌普通肉汤培养基100 μl涂布于普通琼脂平板上，将兽医临床常用的14种敏纸片，每3个药敏纸片等距离贴于一个琼脂平板表面，倒置平皿37℃培养20 h观察、记录结果。

2.3抑菌结果的判定

抑菌结果判定标准见表3。

表3　药物敏感实验判定标准

2.416SrRNA甲基化酶的基因检测

2.4.1模板DNA的提取用质粒提取试剂盒提取纯培养物DNA，水煮作为模板待用。采用Primer 5设计16S rRNA甲基化酶基因1对特异性引物：rmtA。

2.4.216S rRNA甲基化酶［1］基因PCR检测方法PCR反应总体系为50 μl，其中包括ddH2O 36.5 μl、10× Buffer 5 μl、dNTP 4 μl、Easy Taq酶0.5 μl、上下游引物各1 μl、模板2 μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸45 s，扩增30个循环，最后72℃延伸7 min。反应结束后，取6 μl PCR产物，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

3　结果

3.1分离培养与鉴定

在普通琼脂平板上经过37℃培养20 h，生长良好，圆形突起、光滑、湿润、半透明灰白色单个菌落明显［2］。见图1。

图1　腹泻物接种于普通琼脂平板上生长的菌落

挑取普通琼脂平板上典型的单个菌落分别接种到麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基上，37℃培养20 h，在麦康凯琼脂平板及伊红美蓝琼脂平板上分别形成红色菌落和带金属闪光的菌落［2］。可判定为大肠杆菌。见图2、图3。

图2　麦康凯培养基上生长的菌落

图3　伊红美蓝培养基上生长的菌落

挑取麦康凯琼脂培养基上生长的单个、红色菌落接种于营养肉汤培养基中进行纯培养，置于空气浴震荡培养箱中37℃培养20 h。见图4。

图4　肉汤培养基上的生长结果

3.2药敏试验结果

经过药敏试验发现，本次分离的大肠杆菌对诺氟沙星、阿奇霉素、复方新诺明极敏感；对氯霉素、头孢唑林、链霉素、丁胺卡那霉素、四环素、庆大霉素、头孢西丁高度敏感；呋喃妥因中度敏感；而对万古霉素、青霉素、红霉素耐药。见图5、图6。

图5　藏猪源大肠杆菌对常用药物耐药表型结果

图6　药敏试验结果

3.3生化实验结果

对藏猪源细菌经生化试验鉴定，参考5种埃希菌的生化反应［3］，可确定两株藏猪源细菌是埃希氏菌属大肠杆菌。见表4。

表4　藏猪源分离细菌生化试验结果

3.4基因检测实验结果

检测所用的引物中，全部检测出P基因，检出率100%。猪源大肠杆菌对氨基糖苷类药物不敏感，存在耐药基因。见图7。

图7　藏猪源大肠杆菌P基因电泳图

4　讨论

4.1藏猪源大肠杆菌的耐药性

目前，滥用抗生素问题在人类使用上得到了一定的控制，但是在动物身上大量使用抗生素的情况依然非常严重，特别是大动物、家畜，对人类健康的威胁不容小视［4］。共生菌株耐药性逐渐引起公众的关注，因为这类耐药菌株能够不断扩散，将耐药基因从动物传播给人［5，6］，关于大肠杆菌对抗生素的耐药性问题，早已在世界范围内引起了重视［7，8］。

所分离得到的菌株均表现出了耐药，这说明在藏区藏猪临床上也存在大量使用抗生素、或不规范使用抗生素的现象。并在基因检测中全部检验出P基因，所以确定其存在耐药基因。在临床上应分离病原并开展药敏试验，以针对性地选择药物，从而减少或延缓细菌耐药性的产生。

4.2避免耐药性的产生建议

4.2.1改善饲养管理、优化环境卫生肠道中的大肠杆菌大多为正常菌群，属于条件致病菌。所以必须加强藏猪的饲养管理。比如，加强通风换气，减少藏猪圈舍内的有害气体等。

空气、饮水、饲料均是大肠杆菌的主要传播媒介，应优化环境卫生，比如对粪便的及时定期消毒等。特别是猪大肠杆菌病引起的仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病［9］等的粪便及圈舍的处理。处理方法有很多种，如：生物热消毒或使用新洁尔灭、百毒杀等。同时，加强对藏猪圈舍外环境的消毒，比如，对进出养殖场的设备、车辆、人员的控制、消毒，以及定期灭鼠、灭蝇、灭蚊。对于散养藏猪还可以采取一定的隔离措施，比如，建立栅栏。

4.2.2减少用药导致的耐药性产生若藏猪已经发生大肠杆菌病，应该采用多种抗生素交叉、联合使用，按照相关规定合理使用抗生素，以达到提高疗效降低毒性、延缓和避免抗药性产生的目的［10］。

4.2.3加强乡镇一级基层兽医工作人员的培训基层兽医工作人员是牲畜疾病预防及生病牲畜的直接用药指导。因此加强基层兽医工作人员对相关知识的学习，普及相关医疗知识，合理使用抗菌药。以及用药时严格掌握适应症、适当的剂量和疗程，严格按照相关药品使用说明书使用药物，是减少大肠杆菌耐药性产生的一个重要途径。

4.2.4加强药政管理相关行政管理部门必须根据相应法律法规加强抗生素生产、销售、广告、使用的管理，控制新抗菌药的标准，加强抗菌药物的质量监督，大力整顿兽药市场。大肠杆菌耐药性是一个复杂的、持续进化的过程，必须长期与此做斗争。

参考文献：

［1］Galimand M，Courvalin P，Lambert T.Plasmid-mediated high-level resistance to aminoglycosidesin Enterobacteriaceae due to 16S rRNA methylation［J］. Antimicrob Agents Chemother，2003，47（8）：2565-2571.

［2］陆承平.兽医微生物学［M］.北京：中国农业出版社，2011.

［3］房海，陈翠珍，张晓君，等.肠杆菌科病原细菌［M］.北京：中国农业科学技术出版社，2011.

［4］吕津.畜禽滥用抗生素问题亟待解决［N］.北方牧业，2006-1-30.

［5］Klare I，Heier H，Claus H，et al. Enterococcus faecium Strains with vanA-mediated high-level glycopeptide resistance isolated from animal foodstuffs and fecal samples of humans in the community［J］.Microb Drug Resist，1995，（12）：65-72.

［6］Kuhn I，Iversen A，Burman L G，et al.Epidemiology and ecology of enterococci，with special reference to antibiotic resistant strains，in animals，humans and the environment.ExamPle of an ongoing Project within the European research programme［J］.Int J Antimierob Agents，2000，14（3）：37-42.

［7］方雨玲，甘桂娥，杨宜生，等.231株仔猪腹泻致病性大肠杆菌对18种抗菌药物敏感性测定［J］.湖北畜牧兽医，1992，（2）：1-6.

［8］H，Kanai，H，Hashimoto，S，Mitsuhashi . Durg resistance and conjugative R plasntids in feeal E.coli strainsisolated from healthy younger animals（chickens，Piglets，calve and children）［J］.Microbiol Immunol，1983，27（12）：1031-1041.

［9］宣长和，马春全，陈志宝.猪病学（第3版）［M］.北京：中国农业大学出版社，2010.

［10］陈杖榴.兽医药理学（第3版）［M］.北京：中国农业出版社，2012.

（编辑：高真贞）

中图分类号：S858.28

文献标识码：B

文章编号：1006- 799X（2016）05- 0073- 03

基金项目：由西藏大学农牧学院大学生创新性试验项目，西藏大学农牧学院预防兽医学科建设资助。

作者简介：罗润波（1991-），男，四川宜宾人，在读硕士，主要从事高原动物传染病相关工作。

通讯作者：索朗斯珠*